新疆奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌進化 分群及耐藥特性研究

馬 帥，喬 軍，孟慶玲*，伍曄暉，王熙鳳，郭 晶，蔡擴軍，王登峰，才學(xué)鵬

(1．石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2．烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆 烏魯木齊 830063； 3．新疆畜牧科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000； 4．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛飼養(yǎng)過程中常見的產(chǎn)科病，主要由于奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜受損后受外來微生物的入侵，致使奶牛子宮黏膜發(fā)生炎癥，可降低奶牛繁殖率，影響奶牛生產(chǎn)性能[1-2]。該病在奶牛場普遍存在，因地理位置和飼養(yǎng)模式的不同，不同奶牛場子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率也存在較大的差異，我國奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率為20%～50%[3]。

病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌是引起奶牛子宮疾病最常見的病原菌之一[4]。Sheldon等[5]認(rèn)為，從產(chǎn)后奶牛子宮中分離的大腸桿菌主要集中在A群和B1群，而A群和B1群的大腸桿菌是與宿主共生的大腸桿菌。目前，防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要方法是大量使用抗菌藥物。然而，隨著抗菌藥物的大量使用，大腸桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，甚至成為人和動物體內(nèi)耐藥決定因子的“貯藏庫”。同時，耐藥性大腸桿菌可以通過可移動元件中的轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等將耐藥基因進行水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致耐藥性廣泛擴散[6]。

奶牛子宮內(nèi)膜炎嚴(yán)重制約著奶牛業(yè)的發(fā)展，新疆作為我國重要的奶牛養(yǎng)殖基地之一，受到了嚴(yán)重威脅。為了探究新疆地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌分離株的系統(tǒng)分群和耐藥特性，本研究對其進行系統(tǒng)進化分群、耐藥特性及攜帶質(zhì)粒分析，以了解新疆地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌的耐藥水平及多重耐藥質(zhì)粒的傳播，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣品采集

2016年9月至2017年8月從新疆石河子、奎屯、塔城、烏魯木齊等地區(qū)規(guī)?；膛霾杉加信R床型子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物樣品。樣品采集時用干凈溫水清洗奶牛外陰后用75%乙醇棉球擦拭干凈，使用直腸檢查法觸壓子宮壁，棄除最初流出陰道內(nèi)的子宮黏液，收集中間或后面流出的黏液于滅菌離心管中，放入冰盒帶回實驗室進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2 試劑與菌株

16種藥敏紙片和頭孢他啶/克拉維酸(CZV，30/10 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(CXV，30/10 μg)均購于杭州微生物試劑有限公司；伊紅美藍、麥康凱、MH藥敏試驗培養(yǎng)基和LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、PCR反應(yīng)試劑、pMD19-T購于寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；受體菌株E.coliDH5α由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲實驗室提供；大腸桿菌質(zhì)控菌ATCC25922購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 大腸桿菌分離鑒定

用滅菌接種環(huán)沾取少量樣品接種到液體LB中，在水平搖床培養(yǎng)8 h；然后在伊紅美藍培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，置于37 ℃細菌培養(yǎng)箱12～16 h；挑取平板上呈現(xiàn)紫黑色且有金屬光澤的單菌落，劃線于麥康凱培養(yǎng)基上，置于37 ℃細菌培養(yǎng)箱12～16 h；挑取平板上的單菌落，參照文獻[7]中16S rDNA測序法進行擴增和測序比對。采用引物16S-F：5′-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3′；16S-R：5′-TCATCCTCTCAGACCAGCTA-3′，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 大腸桿菌系統(tǒng)進化分群

按照TIANGEN公司基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取分離菌株的基因組DNA。設(shè)計并合成的相關(guān)引物(表1)與四重PCR反應(yīng)條件及判定標(biāo)準(zhǔn)均參照文獻[8]：首先使用四重PCR方法檢測chuA、yjaA、TspE4.C2和arpA4種基因的存在和缺失，然后根據(jù)所獲得的4種基因型對大腸桿菌分離株進行系統(tǒng)分群，由于部分分離株需要經(jīng)過C群特異性引物或E群特異性引物進一步檢測，操作時分別添加內(nèi)部trpA對照引物用于控制DNA模板，所以第二步分別都是雙重PCR。50 μL PCR反應(yīng)體系：PCR Mixture 19 μL，ddH2O 19 μL，模板DNA 4 μL，上、下游引物各1 μL。同時對擴增結(jié)果進行測序驗證。

表1 大腸桿菌分群引物

1.5 藥物敏感性試驗

根據(jù)CLSI中的K-B法對已分離鑒定過的大腸桿菌進行16種藥物的敏感性試驗，首先將分離株分別接種至1 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h，再用滅菌生理鹽水將細菌濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μL均勻涂布于MH藥敏試驗培養(yǎng)基上，然后用滅菌鑷子夾取藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，將貼好藥敏紙片的平板倒置在37 ℃細菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h，大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌。結(jié)果判定按照抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進行，即同一株細菌對3類或3類以上的抗菌藥物耐藥則判定為多重耐藥，并分析不同進化群與耐藥性之間的關(guān)系。

1.6 產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測

根據(jù)CLSI推薦的大腸桿菌產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)進行，選取對頭孢噻肟或頭孢他啶任意一種藥物耐藥的分離株，判斷為可疑產(chǎn)ESBLs大腸桿菌；表型驗證試驗按照CLSI中的K-B紙片擴散法執(zhí)行，藥敏紙片使用頭孢他啶/克拉維酸和頭孢他啶、頭孢噻肟/克拉維酸和頭孢噻肟2對藥敏紙片。判定標(biāo)準(zhǔn)：只要其中1對未加克拉維酸藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑比加了克拉維酸藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑小5 mm，即可判定是陽性菌株。

1.7 耐藥基因檢測

耐藥基因檢測PCR體系為20 μL：ddH2O 10 μL，PCR Mixture 7 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL。耐藥基因引物參照文獻[9-15]設(shè)計,見表2。

表2 耐藥基因引物序列

1.8 大腸桿菌產(chǎn)ESBLs耐藥質(zhì)粒分析

1.8.1 質(zhì)粒提取與鑒定 隨機挑選15株產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌，均為多重耐藥菌株，分別接種在5 mL含頭孢氨芐(LEX，質(zhì)量濃度為30 mg/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃水平搖床培養(yǎng)8～12 h，然后按質(zhì)粒小量提取試劑盒的操作方法提取質(zhì)粒，并對提取的質(zhì)粒DNA進行電泳檢測。

1.8.2 耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選 將成功提取的大腸桿菌質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)化對象，吸取5 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中吹打混勻，冰上放置30 min，在42 ℃水浴鍋中熱激90 s后迅速冰浴5 min，再加入1 mL無抗性LB，置于37 ℃水平搖床培養(yǎng)1 h，取100 μL菌液涂布到含有LEX質(zhì)量濃度為30 mg/mL的LB瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)12～16 h。

1.8.3 質(zhì)粒的耐藥性傳遞鑒定 提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒并與原菌株質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳比對。按照CLSI中的K-B法對轉(zhuǎn)化子進行藥物敏感性試驗，并用空白的E.coliDH5α作對照，判定結(jié)果按照抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的分離與鑒定

從奶牛臨床樣品中共分離到210株大腸桿菌。大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長出圓形、光滑的紅色菌落，在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成帶有金屬光澤的紫黑色菌落；革蘭氏染色鏡檢呈現(xiàn)紅色，兩端鈍圓，呈散在分布的陰性短桿狀菌(圖1)。用引物擴增16S rDNA后，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現(xiàn)了202 bp的目的條帶(圖2)。測序結(jié)果與GenBank上的大腸桿菌16S rDNA序列比對，同源性均為99.43%。

圖1 大腸桿菌革蘭氏染色鏡檢(1 000×)

M：DNA Marker DL2000； 1—6：目的片段圖2 大腸桿菌16S rDNA PCR擴增

2.2 大腸桿菌系統(tǒng)進化分群結(jié)果

采用新Clermont四重PCR系統(tǒng)分型方法對210株奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌進行系統(tǒng)進化分析，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見到arpA(400 bp)、chuA(288 bp)、yjaA(211 bp)、TspE4.C2(152 bp)的目的條帶(圖3)。其中B1群(101/210；48.1%)數(shù)量最多，其次是A群(60/210；28.6%)、C群(27/210；12.9%)、E群(14/210；6.7%)、D群(8/210；3.8%)。

M：DNA Marker DL700； 1：A群(+ - - -)； 2：A群(+ - + -)； 3：C群(+ - + -)； 4：B1群(+ - - +)； 5：E群(+ + - -)； 6：D群(+ + - -)； 7：陰性對照 圖3 新Clermont四重PCR系統(tǒng)分型結(jié)果

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果

大腸桿菌各群對16種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，其中多重耐藥菌株集中在B1群，A群僅對復(fù)方新諾明全部敏感，C群、D群和E群對藥物的敏感種類多于B1群和A群。所有藥物中耐藥最嚴(yán)重的是紅霉素、氨芐西林、慶大霉素、頭孢氨芐、鏈霉素，耐藥率分別為95.2%(200/210)、83.3%(175/210)、73.8%(155/210)、71.9%(151/210)、70.5%(148/210)；菌株對諾氟沙星耐藥率最低，耐藥率為6.2%(13/210)，其次是復(fù)方新諾明、氯霉素、多西環(huán)素，分別為6.7%(14/210)、10.0%(21/210)、10.5%(22/210)。多重耐藥性嚴(yán)重，主要集中在對4～10種藥物耐藥。多重耐藥率高達98.6%(207/210)，其中耐7種藥物以上的菌株占67.6%(142/210)(表3和圖4)。

2.4 產(chǎn)ESBLs菌株表型初篩及確證

通過表型初選結(jié)果得出126株產(chǎn)ESBLs菌株，占總菌數(shù)的60%；對126株初篩菌株進行表型確證(圖5)，共檢測出55株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，占總菌數(shù)的26.2%。

表3 大腸桿菌各進化群藥敏試驗結(jié)果

注：括號內(nèi)的數(shù)字是耐藥率(%)。

圖4 大腸桿菌多重耐藥統(tǒng)計

圖5 產(chǎn)ESBLs菌株表型確證結(jié)果(陽性)

2.5 耐藥基因檢測結(jié)果

對210株大腸桿菌進行相關(guān)耐藥基因的檢測(圖6—9)。結(jié)果表明，11種耐藥基因中，blaTEM和aac(6′)- Ⅰb是最流行的耐藥基因，檢出率為90.5%(190/210)和88.1%(185/210)，其次是ant(3″)-Ⅰa、aacC2 (aac(3)-Ⅱ)、blaCTX-M、aph(3′)-Ⅱa、rmtB、blaSHV，分別為70.0%(147/210)、64.3%(135/210)、58.1%(122/210)、37.6%(79/210)、18.6%(39/210)、11.4%(24/210)。mcr-1、qnrA和qnrS檢出率則相對較低，分別為7.1%(15/210)、2.4%(5/210)和1.9%(4/210)。耐藥基因的檢測結(jié)果與耐藥表型基本一致。

M:DNA Marker DL2000; 1—4:目的基因; 5:陰性對照圖6 blaTEM基因PCR產(chǎn)物電泳

M:DNA Marker DL2000; 1—4:目的基因; 5:陰性對照圖7 blaCTX-M基因PCR產(chǎn)物電泳

M：DNA Marker DL2000； 1—4:目的基因； 5：陰性對照圖8 blaSHV基因PCR產(chǎn)物電泳

M：DNA Marker DL2000； 1—4：分別為ant(3″)-Ⅰa、aph(3′)-Ⅱa、aacC2 (aac(3)-Ⅱ)、aac(6′)-Ⅰb基因； 5：陰性對照圖9 ant(3″)-Ⅰa、aph(3′)-Ⅱa、aacC2 (aac(3)-Ⅱ)、aac(6′)-Ⅰb基因PCR產(chǎn)物電泳

2.6 大腸桿菌產(chǎn)ESBLs耐藥質(zhì)粒分析

選取的15株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌均能分離出質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，有8株菌在含LEX的固體LB培養(yǎng)基上生長出少量菌落，其他菌株沒有菌落生長，總轉(zhuǎn)化率為53.3%。提取轉(zhuǎn)化成功后的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒并與原菌株質(zhì)粒進行電泳檢測，通過質(zhì)粒電泳圖譜發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子含有原菌株部分或全部的質(zhì)粒條帶，且

多數(shù)原菌株質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒都有23.13 kb的條帶(圖10)，將提取的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入到E.coliDH5α中，得到了相同的轉(zhuǎn)化子，同時3次連續(xù)轉(zhuǎn)化后的結(jié)果均相同。

E.coliDH5α作為基因工程菌，對所有抗菌藥物不產(chǎn)生抗性，因此耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化子所表現(xiàn)的耐藥性是耐藥質(zhì)粒的抗性水平。對8株攜帶有ESBLs質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子進行藥物敏感性試驗，試驗結(jié)果與供體菌比較可知，8株轉(zhuǎn)化子對16種供試藥物的耐藥率與供體菌具有一定的相似性，轉(zhuǎn)化子不僅對部分β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性，對其他供試藥物也表現(xiàn)出與供體菌類似的耐藥性，并且均表現(xiàn)出對3種及以上藥物耐藥(表4)。供體菌和轉(zhuǎn)化子對氨芐西林、慶大霉素、頭孢氨芐的轉(zhuǎn)移率均為100%，其他藥物的轉(zhuǎn)移率則相對較低(表5)，表明通過轉(zhuǎn)化，質(zhì)?？梢詳y帶1個至數(shù)個耐藥基因，可以將供體菌的耐藥性部分或全部轉(zhuǎn)移。

M：λDNA/HindⅢ Marker； 1—8：原菌株質(zhì)粒； 1-1—8-1：轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒圖10 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒與原菌株質(zhì)粒電泳圖譜表4 供體菌與轉(zhuǎn)化子的耐藥表型

菌株供體菌轉(zhuǎn)化子1STR-GEN-AMP-AMI-CTX-EM-LEXSTR-GEN-AMP-LEX2STR-GEN-AMP-LEX-CAZ-KAN-POL-DOX-EMGEN-AMP-LEX3GEN-AMP-LEX-DOX-CAZ-EMGEN-AMP-LEX-DOX4GEN-AMP-LEX-STR-EM-CTX-TET-KAN-NORGEN-AMP-LEX-CTX5GEN-AMP-LEX-EM-KAN-NOR-AMI-POL-EMGEN-AMP-LEX-POL6GEN-AMP-LEX-AMI-STR-CTX-KAN-NOR-CTX-CAZ-EMGEN-AMP-LEX-AMI-CAZ-KAN7GEN-AMP-LEX-KAN-AMI-CAZ-EMGEN-AMP-LEX-KAN-AMI-CAZ8GEN-AMP-LEX-CTX-KAN-AMI-STR-EMGEN-AMP-LEX-AMI-STR

表5 供體菌與轉(zhuǎn)化子對16種抗菌藥物的耐藥情況

續(xù)表5 供體菌與轉(zhuǎn)化子對16種抗菌藥物的耐藥情況

3 結(jié)論與討論

大腸桿菌是奶牛子宮內(nèi)膜炎重要的致病菌之一，對奶牛產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。Clermont等[8]使用四重PCR系統(tǒng)分群方法將大腸桿菌分為A、B1、B2、C、D、E、F和cladeⅠ8個進化群。根據(jù)大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果，腸外致病性大腸桿菌主要分布在B2和D群，而共生性大腸桿菌則集中在B1和A群[16]。本研究將210株分離株共分成B1群(48.1%)、A群(28.6%)、C群(12.9%)、E群(6.7%)和D群(3.8%)5個群，且多重耐藥菌株主要集中在B1群，A群僅對復(fù)方新諾明敏感。與曾莉[17]報道的3種不同來源大腸桿菌分為A群(45%)、B1群(16%)、F群(14%)、D群(6%)、C群(3%)，未檢出E群和B2群的進化結(jié)果相比，本試驗分離大腸桿菌主要集中在A群，檢測出E群而未檢測出B2群。王一昊[3]對產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，主要為B1群，其次是A群和D群，沒有分離到B2群，并推斷A群可能是主要的致病菌，而B1群是原住大腸桿菌或潛在的條件致病菌。Iranpour等[18]發(fā)現(xiàn)，分離自醫(yī)院病人尿路感染的大腸桿菌中B2群(39.3%)分布最多，其次是未分型成功(27.1%)、E群(9.3%)、C群(6.4%)、clade Ⅰ 群(6.4%)、B1群(5%)、F群(2.9%)和D群(2.9%)。本試驗中各進化群檢出率與以上報道存在差異性，可能是由于地理位置和菌株來源的不同所造成。

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離株對大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類耐藥率較高，而對其他類藥物耐藥率較低。產(chǎn)ESBLs大腸桿菌占到總數(shù)的26.2%。多重耐藥菌株主要集中在4～10耐，多重耐藥率高達98.6%。Malinowski等[19]對99株分離自奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥性進行分析，發(fā)現(xiàn)分離株對諾氟沙星最敏感，其次是慶大霉素，敏感率分別為100%和96%。韓淑芳等[20]從山西某奶牛場25份奶樣中分離得18株金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)對9種抗生素產(chǎn)生普遍耐藥性，其中對阿莫西林耐藥率最高，達77.8%。馮世文等[21]分析2016年采自25個廣西豬場腹瀉仔豬的200份樣品，分離得103株致病性大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)2016年廣西豬源致病性大腸桿菌以廣譜耐藥為主，多為11重耐藥以上，占74.8%。Laarem等[22]從新鮮的生雞肉樣本中分離出29株大腸桿菌，其中耐四環(huán)素的菌株占96.6%。本研究中分離株的藥物敏感性試驗與前人的研究結(jié)果存在差異，可能是因為臨床用藥及樣品來源的不同所致。對blaTEM、blaCTX-M、blaSHV多種耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，同時在39株攜帶rmtB基因的大腸桿菌中檢測出blaTEM、blaCTX-M基因。在檢測的4種氨基糖苷類修飾酶基因中，aac(6′)-Ⅰb分布最多，為88.1%。其他耐藥基因檢出率較少，但耐藥基因之間存在交叉耐藥，本試驗?zāi)退幈硇团c耐藥基因的檢出率基本符合。建議臨床上選擇敏感性高的藥物如諾氟沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素等。Zhao等[23]對內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥基因檢測，僅檢測出blaTEM基因(100%)，未發(fā)現(xiàn)blaCTX-M、blaSHV。底麗娜[24]報道新疆不同動物源耐藥基因檢出情況，32株牛源大腸桿菌中blaTEM和rmtB檢出率分別為15.63%和50%，其中4株分離株同時帶有blaTEM和rmtB基因。與以上研究相比，新疆地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌普遍存在耐藥性，且耐藥基因檢出率較高，耐藥問題更嚴(yán)峻，需引起重視。

耐藥質(zhì)粒是導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性的一個重要因素，耐藥基因可通過耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和結(jié)合等方式進行水平傳播。有研究報道，產(chǎn)ESBLs基因中的CTX-M、TEM、SHV和氨基糖苷類中的rmtB基因通常由質(zhì)粒介導(dǎo)，這些基因可同時在同一質(zhì)粒上，并可通過轉(zhuǎn)化進行傳播和擴散[12,25]。本試驗對質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs基因進行研究，成功獲得了8株轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子含有原供體菌全部或部分質(zhì)粒條帶，均呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，對頭孢類藥物耐藥的菌株也對氨基糖苷類藥物耐藥。