長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響因子分析

摘 要：以長葉點(diǎn)地梅（Androsace longifolia）無菌實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，研究植物生長調(diào)節(jié)劑、大量元素、瓊脂、蔗糖、暗處理等因子對長葉點(diǎn)地梅愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，2，4-D更適合長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)愈傷組織最適宜的培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基附加1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，誘導(dǎo)率為95.0%；暗處理不利于長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：長葉點(diǎn)地梅；愈傷組織誘導(dǎo)；影響因子

中圖分類號：Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.031

Abstract： Taking Androsace longifolia sterile seedlings as experimental materials， the effects of plant growth regulator， macroelement， agar， sugar and dark treatment on Androsace longifolia blade callus induction was studied. The results showed that 2，4-D better suited to Androsace longifolia blade callus induction， the most suitable medium was MS basic medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.2 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar， induction rate was 95.0%； dark treatment was not conducive Androsace leaf callus induction.

Key words： Androsace longifolia； callus induction； impact factor

長葉點(diǎn)地梅（Androsace longifolia） ，為報(bào)春花科點(diǎn)地梅屬的多年生草本花卉，生于多石礫的山坡，崗頂和礫石質(zhì)草原，對生境要求低，適應(yīng)性強(qiáng)，具有較好的耐踐踏性，是一種良好的園林地被植物。其植株低矮，花朵嬌小，花色清新，東北地區(qū)的花期在5月份左右[1]，是該地區(qū)難得的早春花卉，具有很高的觀賞價(jià)值。據(jù)報(bào)道點(diǎn)地梅屬植物具有一定藥用價(jià)值[2-8] ，可以顯著提高人肝癌細(xì)胞抗增殖活性等[9]，長葉點(diǎn)地梅的園林開發(fā)應(yīng)用極少，多處于野生狀態(tài)，對其相關(guān)研究鮮有報(bào)道。目前，對報(bào)春花科報(bào)春花屬的植物組織培養(yǎng)研究的較多，點(diǎn)地梅屬植物組織培養(yǎng)方面的研究迄今很少。聶勇[10]以點(diǎn)地梅[A.umbellate（Lour.）Merr.]無菌苗的嫩葉為外植體，研究了不同質(zhì)量濃度下的2，4-D和6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。張彥妮等[11-12]對長葉點(diǎn)地梅愈傷組織的誘導(dǎo)和植株的再生以及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件進(jìn)行了研究。但這些文獻(xiàn)均未對長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響因子進(jìn)行較為全面的研究。

愈傷組織是指在培養(yǎng)或自然條件下，植物細(xì)胞脫分化不斷增殖所產(chǎn)生的主要由薄壁細(xì)胞構(gòu)成的組織。其誘導(dǎo)成功與否影響到組織培養(yǎng)后續(xù)的研究。研究表明，愈傷組織的形成除了與創(chuàng)傷有關(guān)外，還主要與植物內(nèi)源或外源的激素有關(guān)[13]。因此，在愈傷組織誘導(dǎo)的過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度最為重要，研究最完善。然而，影響外植體愈傷誘導(dǎo)的因素諸多且少有系統(tǒng)分析，尤其忽略了大量元素、瓊脂濃度、碳源及暗處理等條件在愈傷誘導(dǎo)過程中的影響。本研究探討植物生長調(diào)節(jié)劑、大量元素 、瓊脂濃度、碳源及暗處理對長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響，以期進(jìn)一步完善長葉點(diǎn)地梅組培快繁技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

長葉點(diǎn)地梅無菌實(shí)生苗。

1.2 方 法

1.2.1 6-BA 與NAA2，4-D組合對長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷的影響 將長葉點(diǎn)地梅無菌實(shí)生苗的葉片切成0.5 cm2左右的小塊，接入不同濃度2，4-D和6-BA組合及NAA和6-BA組合的MS培養(yǎng)基（表1）上，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)外植體。30 d后，統(tǒng)計(jì)葉片的誘導(dǎo)率、愈傷的長勢等指標(biāo)。

1.2.2 大量元素對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響 以長葉點(diǎn)地梅葉片為外植體，根據(jù)1.2.1試驗(yàn)結(jié)果，確定激素濃度配比，探究大量元素對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響，培養(yǎng)基類型分別為MS、1/2MS、1/4MS，每種培養(yǎng)基接種20個(gè)外植體，30 d后，統(tǒng)計(jì)分析誘導(dǎo)率及愈傷長勢等。

1.2.3 碳源、瓊脂、暗處理對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響 以1.2.1與1.2.2結(jié)果，確定培養(yǎng)基種類，以長葉點(diǎn)地梅葉片為外植體（20個(gè)），比較不同碳源（蔗糖、麥芽糖、葡萄糖）、瓊脂濃度（分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 g·L-1）、暗處理（7，14，21 d）等因素對葉片愈傷誘導(dǎo)的影響，30 d后，統(tǒng)計(jì)分析誘導(dǎo)率及愈傷長勢等。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA與 NAA或2，4-D組合對長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

結(jié)果表明（圖1），2，4-D與6-BA組合中，在M4的培養(yǎng)基上，葉片誘導(dǎo)愈傷的效果最佳，誘導(dǎo)率高達(dá)83.3%；與6-BA組合中，最佳培養(yǎng)基為N3，誘導(dǎo)率為53.3%。當(dāng)各組合中激素配比相同時(shí)，2，4-D和6-BA組合的誘導(dǎo)率均高于NAA和6-BA的組合，這表明，2，4-D提高葉片的愈傷誘導(dǎo)率的效果更佳。此外，在M4與N3的培養(yǎng)基中，愈傷啟動期分別為13，12 d，差距不大；愈傷組織的形態(tài)指標(biāo)相似，均呈淡綠色，結(jié)構(gòu)疏松（圖2，圖3），這表明，兩種培養(yǎng)基均能在較短的時(shí)間內(nèi)得到分化能力較好的愈傷組織。因此，葉片誘導(dǎo)愈傷最佳激素配比為M4，即1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA，與NAA相比，2，4-D更利于長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2 大量元素對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

大量元素是生物生長所需的必備元素，不同植物對大量元素含量的要求不同，大量元素對葉片誘導(dǎo)愈傷具有重要影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷的最適培養(yǎng)基為MS（圖4）。隨著大量元素濃度的降低，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率呈下降趨勢。在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率達(dá)95%，產(chǎn)生的愈傷最多，愈傷組織呈淡綠色，質(zhì)量大于0.6 g，長勢最好；1/4MS培養(yǎng)基上的葉片愈傷組織誘導(dǎo)率僅為50%，愈傷組織質(zhì)量小于0.3 g，長勢最差。

2.3 碳源、瓊脂、暗處理對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

培養(yǎng)基中的瓊脂除有固化作用外，也會吸附外植體的代謝產(chǎn)物，因此不同濃度的瓊脂對外植體的生長有不同程度的影響。結(jié)果（圖5）表明：瓊脂濃度對誘導(dǎo)率有較大的影響，愈傷組織誘導(dǎo)率在一定瓊脂濃度內(nèi)升高，當(dāng)瓊脂濃度達(dá)到8.0 g·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最大值95%。啟動期不受瓊脂濃度的影響，隨著瓊脂濃度變化，葉片愈傷的啟動期均保持在13～15 d。形態(tài)指標(biāo)上，當(dāng)瓊脂濃度為5.0 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)基呈半固體狀態(tài)，愈傷組織質(zhì)地疏松，長勢不佳。隨著瓊脂濃度逐漸增加，愈傷組織的長勢越來越好，瓊脂濃度為8.0 g·L-1時(shí)，愈傷組織呈淺綠色，長勢最好。當(dāng)瓊脂濃度為9.0 g·L-1時(shí)，愈傷組織顏色加深，質(zhì)地相對緊實(shí)，長勢不佳。這表明瓊脂在高濃度的條件下，培養(yǎng)基硬度加強(qiáng)，不利于外植體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此，長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷最佳瓊脂濃度為8.0 g·L-1。

不同植物材料對碳源的吸收狀況不同，因此對碳源種類的要求也不同。培養(yǎng)基上添加濃度均為3%的麥芽糖、葡萄糖，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)：蔗糖作為碳源時(shí)誘導(dǎo)的愈傷最佳，誘導(dǎo)率達(dá)90%，愈傷組織的生長狀況最好，產(chǎn)生愈傷組織較多。誘導(dǎo)率最低的為葡萄糖，產(chǎn)生的愈傷較少。3種碳源的混合效果與單一碳源的作用效果相差不大。在各組合中，愈傷誘導(dǎo)效果最佳的是50%蔗糖與50%麥芽糖混合，誘導(dǎo)率為61.0%，比單一使用麥芽糖、葡萄糖時(shí)有較小程度的提高，但低于單獨(dú)使用蔗糖時(shí)的誘導(dǎo)率，因此長葉點(diǎn)地梅愈傷組織誘導(dǎo)蔗糖為最佳碳源，不宜使用混合碳源。

將外植體進(jìn)行不同時(shí)間的暗處理后發(fā)現(xiàn)：暗處理4 d后，葉片開始變黃，暗處理7 d后移至光下培養(yǎng)，光下培養(yǎng)14 d后開始產(chǎn)生愈傷，誘導(dǎo)率僅為5%，愈傷組織呈黃綠色，長勢一般，葉片切口處有褐化發(fā)生，且培養(yǎng)基受到褐化物質(zhì)的污染。葉片在暗處理14 d和21 d后，均無愈傷組織產(chǎn)生，且葉片失綠，外植體變黑褐色死亡。因此，長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷時(shí)不適合進(jìn)行暗處理。

3 結(jié)論與討論

目前，長葉點(diǎn)地梅在組織培養(yǎng)方面的研究較少，僅局限于生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度。植物愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及形態(tài)建成主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境等3大因素的調(diào)控[14]，但少有人對其系統(tǒng)地比較研究。本試驗(yàn)對生長調(diào)節(jié)劑、大量元素 、瓊脂濃度、碳源及暗處理對長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，誘導(dǎo)率達(dá)95.0%。一般認(rèn)為，NAA更利于芽的增值，2，4-D在愈傷組織的誘導(dǎo)過程中較為常用，本研究也得到相似結(jié)論，認(rèn)為2，4-D更適合長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷，可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率。時(shí)永杰等[15]以白羊草（Bothriochloa ischaemum）幼穗為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在暗光培養(yǎng)條件下，更利于愈傷組織的產(chǎn)生與生長。本試驗(yàn)將葉片先進(jìn)行不同時(shí)間的暗處理（7，14，21 d），再置于光下誘導(dǎo)愈傷，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，暗處理不利于長葉點(diǎn)地梅葉片對愈傷的誘導(dǎo)。差異的產(chǎn)生可能是由于不同植物材料對光照的要求不同，也體現(xiàn)了本研究對暗處理這一條件探究的意義。

以上研究結(jié)果表明，生長調(diào)節(jié)劑、瓊脂濃度及暗處理，不僅對長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷的數(shù)量有影響，而且也影響所誘導(dǎo)愈傷的質(zhì)量。愈傷組織的質(zhì)量是影響長葉點(diǎn)地梅再生的關(guān)鍵性因素，一般情況下，淡綠色疏松的愈傷組織質(zhì)量較好，分化能力較強(qiáng)，而其他因子只對誘導(dǎo)率即愈傷組織的數(shù)量有較大的影響。本研究通過對生長調(diào)節(jié)劑、大量元素 、瓊脂濃度、碳源及暗處理等因子影響長葉點(diǎn)地梅葉片誘導(dǎo)愈傷的的探索，為進(jìn)一步完善長葉點(diǎn)地梅組培快繁體系奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 柳參奎. 中國東北鹽堿地植物原色圖鑒[M]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)出版社， 2006： 123.

[2] 李承花， 殷志琦， 黃曉君， 等. 點(diǎn)地梅的化學(xué)成分[J]. 中國天然藥物， 2008， 6（2）： 123.

[3] 雷軍， 肖云川， 王文靜， 等. 點(diǎn)地梅中的黃酮苷成分[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（17）： 2353.

[4] 王文靜， 雷軍， 肖云川， 等. 點(diǎn)地梅中雙黃酮類化學(xué)成分的分離和鑒定[J]. 華西藥學(xué)雜志， 2011， 26（5）： 420.

[5] Lei J， Xiao Y C， Huang J， et al. Two new kaempfero lglycosides from Androsace umbella-ta[J]. Helv Chim Acta， 2009， 92（7）： 1 439.

[6] Dong W， Liu X， Li X， et al. A new triterpene saponinfrom Androsace integra[J]. Fitotera-pia， 2011， 82（5）： 782.

[7] Park J H， Kwak J H， Khoo J H， et al. Cytotoxic effects of triterpenoid saponins from Androsace umbellate against multidrug resistance（MDR） and non-MDR cells[J]. Archives of Pharmacal Research， 2010， 33（8）： 1 175.

[8] Wang Y， Zhang D， Ye W， et al. Triterpenoid saponins from Androsace umbellata and their anti-proliferative activities in human hepatoma cells[J]. Planta Med， 2008， 74 （10）： 1 280.

[9] 黃先麗， 王曉靜， 賈獻(xiàn)慧. 點(diǎn)地梅的揮發(fā)油成分分析[J]. 食品與藥品， 2009， 11（3）： 37.

[10] 聶勇. 2，4-D和6-BA對點(diǎn)地梅愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 阿壩師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2006， 23（4）： 127-128.

[11] 張彥妮， 陳素波. 長葉點(diǎn)地梅愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2012， 29（6）： 931-936.

[12] 張彥妮， 陳素波. 長葉點(diǎn)地梅愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2014， 31（8）： 1 481-1 486.

[13] 姚敦義.植物形態(tài)發(fā)生學(xué)[M].北京：高等教育出版社，1994：42，95.

[14] 谷瑞升， 蔣湘寧， 郭仲琛. 植物立體培養(yǎng)中器官發(fā)生調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)通報(bào) ， 1999， 16（3）： 1-4.

[15] 時(shí)永杰 ， 孫曉萍， 劉曉強(qiáng). 白羊草幼穗的組織培養(yǎng)[J]. 草業(yè)科學(xué)， 1998（12）： 19-20.