附子注射液對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝及骨密度的影響*

裴雅松，唐漢慶，鄭豪芬，蘇永華，李曉華

(1.右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，百色 533000；2.廣西壯族自治區(qū)欽州市中醫(yī)醫(yī)院骨科，欽州 535000)

附子注射液對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝及骨密度的影響*

裴雅松1，2，唐漢慶1，鄭豪芬2，蘇永華2，李曉華1

(1.右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，百色 533000；2.廣西壯族自治區(qū)欽州市中醫(yī)醫(yī)院骨科，欽州 535000)

目的 觀察附子注射液對大鼠去卵巢骨質疏松模型骨代謝及骨密度(BMD)的影響。方法 將60只清潔級Wistar雌性大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、附子小劑量組、附子中劑量組、附子大劑量組、陽性對照組，每組10只。模型對照組、附子小劑量組、中劑量組、大劑量組、陽性對照組切除卵巢。附子小、中、大劑量組分別給予附子注射液 5，10，20 g·kg-1、陽性對照組給予雌二醇注射液 0.05 g·kg-1，尾靜脈注射，假手術組、模型對照組則分別給予同體積0.9%氯化鈉溶液。均1次·d-1，連續(xù)8周 。檢測血清鈣(Ca)、磷(P)、BMD、子宮質量指數(shù)、骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(Cr)、脫氧吡啶啉(DPD)、骨小梁厚度、骨小梁間距。結果 與假手術組比較，模型對照組血清Ca、P水平、骨小梁間距、尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)，而BMD、子宮質量指數(shù)、BGP、ALP、骨小梁厚度均顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，附子大劑量組、陽性對照組血清Ca、P水平、骨小梁間距、尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均降低(P<0.05 或P<0.01)。而BMD、骨小梁厚度、BGP、ALP顯著升高(P<0.01)，且陽性對照組子宮質量指數(shù)顯著升高(P<0.01)。結論 附子注射液和雌二醇均能改善骨質疏松部分骨代謝生化指標，而大劑量附子注射液對子宮的刺激作用較雌二醇弱，其機制有待探究。

附子注射液；骨質疏松癥；卵巢切除術；代謝,骨

骨質疏松癥(osteoporosis) 以低骨量、骨組織的微觀結構損害為特征，與成骨細胞的骨形成能力及破骨細胞的骨吸收能力之間的失衡有關，各種原因使骨吸收大于骨形成，從而造成骨量的丟失，從骨量減少發(fā)展到骨質疏松癥是一種起病隱匿的慢性病[1]。中醫(yī)學根據(jù)“腎主骨”的理論，臨床多采用補腎生髓方藥進行治療。附子具有補火助陽、溫腎散寒等功效，近年研究表明附子功效的發(fā)揮與垂體-腎上腺-性腺軸有聯(lián)系[2-4]。筆者推測附子溫腎助陽作用可能通過垂體-腎上腺-性腺軸對骨代謝生化指標及骨結構有一定的影響。大鼠卵巢切除模型與臨床絕經(jīng)后骨質疏松癥表現(xiàn)相似度較高，是使用最普遍的實驗用骨質疏松癥動物模型[5]。因此，筆者建立去卵巢大鼠骨質疏松模型，以附子注射液作為干預藥物，觀察其對模型大鼠骨代謝生化指標及骨結構的影響，為附子的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar雌性大鼠60只，體質量205～265 g，右江民族醫(yī)學院科學實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2012-0008。實驗動物使用許可證號：SYXK(桂)2012A023。分開單籠分籠飼養(yǎng)，室溫(23±2) ℃，相對濕度(60±5)%，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水和攝食，實驗中對動物的處理遵循相關動物使用倫理學原則。

1.2 藥物和試劑 附子注射液(主要成分烏頭堿，純度≥99.2%，國家標準物質網(wǎng))；戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，批號：20110621)；雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)，批號：080401)；血清鈣試劑盒(Ca，北京博奧公司，批號：00321101)、磷試劑盒(P，北京博奧公司，批號：120343121)。堿性磷酸酶試劑盒(alkaline phosphatase，ALP，Randox公司，批號：32125)；肌酐試劑盒(creatinine，Cr，Roche公司，批號：65394502)；脫氧吡啶啉試劑盒(deoxypyridinoline，DPD，Metra Biosystem公司，批號：9002347)；骨鈣素放免試劑盒(BGP，北京博奧公司，批號：041238)。

1.3 儀器 普利賽斯電子天平(XT220A型，上海麥聚瑞電子儀器有限公司)；生物顯微鏡(DM1000，萊卡)；電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(KD-2258-Ⅵ型，浙江科迪儀器設備有限公司)；高速低溫離心機(PK121R型，ALC 公司)；雙能X 線骨密度測定儀(DCS-600R型，Aloka，Japan)；智能放免測量儀(SN- 695B 型，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)；自動生化分析儀(RTX-90，Beckman公司，USA)。

1.4 動物分組與造模 60只清潔級Wistar雌性大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術組，模型對照組，附子小、中、大劑量組，陽性對照組，共6組，每組10只。其中模型對照組和附子小、中、大劑量組、陽性對照組均施行卵巢切除手術[6]：大鼠仰臥位腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1麻醉，嚴格無菌操作下正中腹部切口，鈍性分離肌肉組織和腹膜，沿輸卵管上行查尋卵巢，應用7號手術縫線在輸卵管壺腹處進行結扎，完整切除雙側卵巢后撒上青霉素粉，縫合皮膚，消毒傷口。假手術組手術路徑相同，但不切除卵巢，只用鑷子輕輕夾出卵巢再送回縫合關腹。術后均連續(xù)灌服青霉素3 d，以預防感染。術后均普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。術后恢復2周后附子小、中、大劑量組分別以附子注射液5，10，20 g·kg-1尾靜脈注射，陽性對照組則以雌二醇注射液0.05 g·kg-1尾靜脈注射，假手術組、模型對照組則分別給予同體積0.9%氯化鈉溶液，均每天1次，連續(xù)8周。8周后第1天禁食12 h 取材檢測。

1.5 血清Ca、P、ALP、Cr、 DPD、BGP測定 處死前分別稱各組大鼠體質量，并收集清晨尿液，心臟取血12 mL，4 ℃，2 000 r ·min-1(r=12.4 cm)離心10 min，取上清液，-80 ℃保存。測血清Ca、P、ALP、BGP水平和尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平，分別按照試劑盒說明進行操作檢測。

1.6 骨密度(bone mineral density，BMD)測定 應用雙能X 線骨密度測定儀和軟件進行大鼠左股骨掃描并測定 BMD值。

1.7 子宮質量指數(shù)測定 取材前大鼠稱定質量，處死后取大鼠子宮，輕壓擠出子宮液體，濾紙吸干，稱定質量。為避免大鼠個體質量差異對實驗的影響，按下列公式計算：子宮質量指數(shù)=大鼠子宮質量/大鼠質量。

1.8 骨組織計量分析 大鼠處死后取右股骨，剔除肌肉筋膜組織，稱定質量，4%多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四醋酸二鈉溶液脫鈣 4周，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗2次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋組織切片，厚度5 μm，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，生物顯微鏡、自動圖像分析儀觀察，進行骨組織計量分析，計算骨小梁厚度、骨小梁間距。

2 結果

2.1 大鼠情況 大鼠術后2～3 h完全清醒，可正常進食。48 h后切口無紅腫，可正?；顒?，72 h后切口無感染。全部大鼠2周后切口均Ⅰ期愈合，沒有死亡脫落，均納入統(tǒng)計分析。

2.2 血清Ca、P、BMD、BGP、ALP水平及子宮質量指數(shù)測定 與假手術組比較，模型對照組血清Ca、P水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而BMD、BGP、ALP及子宮質量指數(shù)均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組比較，附子小劑量、中劑量組Ca、P水平均降低，BMD、BGP、ALP及子宮質量指數(shù)均升高，但差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。而附子大劑量組Ca、P水平均顯著降低，BMD、BGP、ALP顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。子宮質量指數(shù)也升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，陽性對照組血清Ca、P水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而BMD、BGP、ALP升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)，子宮質量指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。附子大劑量組與陽性對照組各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平測定結果 與假手術組比較，模型對照組尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)。與模型對照組比較，附子小劑量、中劑量組尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均下降，但差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而附子大劑量組尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)。與模型對照組比較，陽性對照組尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)。附子大劑量組與陽性對照組各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 大鼠骨小梁厚度、骨小梁間距測定結果 與假手術組比較，模型對照組骨小梁厚度顯著減少，骨小梁間距顯著增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組比較，附子小劑量、中劑量組骨小梁厚度增大，骨小梁間距減小，但差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而附子大劑量組骨小梁厚度顯著增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，骨小梁間距減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，陽性對照組骨小梁厚度增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，骨小梁間距減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。附子大劑量組與陽性對照組各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 6組大鼠血清Ca、P、BMD、BGP、ALP及子宮質量指數(shù)比較

與假手術組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

表2 6組大鼠尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平比較

與假手術組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與模型對照組比較，*3P<0.01，*4P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05，*2P<0.05；Compared with model control group，*3P<0.01，*4P<0.05

表3 6組大鼠骨小梁厚度和骨小梁間距比較

與假手術組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

3 討論

由于附子對心血管系統(tǒng)的不良反應，對附子注射液劑量參考文獻[7]確定的靜脈注射半數(shù)致死量(LD50)和參考文獻[8]單體藥物人體試驗與動物實驗給藥劑量間等效劑量情況進行折算而確定，將附子注射液劑量定在安全范圍內(nèi)，對雌二醇計量參考文獻[8]而確定。

骨吸收如果強于骨形成，則會引起骨量減少，甚至出現(xiàn)骨質疏松癥，骨吸收過程與破骨細胞聯(lián)系緊密，而骨形成過程與成骨細胞的功能狀態(tài)較密切，若破骨細胞功能過強，骨吸收增強，可引起骨中Ca、P的流失，表現(xiàn)為BMD的減小、血清Ca、P水平的升高[9]。反映骨吸收代謝過程中，尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平是較常用的檢測指標[10]。而對于骨形成過程與成骨細胞功能狀態(tài)，以BGP和ALP為最常用的指標，能直接反映骨形成的代謝強度[11]。BGP是成骨細胞成熟的特異標志物，隨著骨礦物質增加和成骨細胞的分化而分泌增加，上調BGP的藥物對骨質疏松有抑制作用[12]。ALP是成骨細胞的一種胞外酶，為多糖蛋白，主要為骨的鈣化提供磷酸，有利于骨的形成，ALP水平為臨床治療骨質疏松癥提供可靠的指標。

在本實驗中，與假手術組比較，模型對照組尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平升高，血清Ca、P水平均顯著升高，而BMD、BGP、ALP及子宮質量指數(shù)均顯著降低，同時，骨小梁厚度顯著減少，骨小梁間距顯著增大，說明模型對照組出現(xiàn)骨代謝異常表現(xiàn)[13]。采用附子注射液干預后，上述指標的異常表現(xiàn)得到了不同程度的糾正或恢復。本實驗設立的3個劑量附子注射液組對上述指標影響沒有顯示出明顯的量效關系。小劑量組和中劑量組雖能使上述指標得到一定恢復和改善，但與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。而以大劑量組的改變比較明顯，使上述指標接近或趨向假手術組水平，與模型對照組比較均差異有統(tǒng)計學意義。說明與一些具有溫腎助陽、填精益髓中藥復方[14]比較，單味藥可能需要更大的劑量才能起效，這與單味藥可能僅作用于機體某些環(huán)節(jié)而中藥復方對機體具有全身性調節(jié)、作用于多環(huán)節(jié)和多通路有關，這些差別也提示如果能將不同功效的單味中藥進行合理組方用藥，就有可能為預防和治療骨質疏松癥發(fā)掘出新的藥物。

附子注射液大劑量組與陽性對照組均能改善骨質疏松癥骨代謝異常表現(xiàn)，但兩者的作用還是稍有不同，與模型對照組比較，陽性對照組子宮質量指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義。而附子注射液3個劑量組子宮質量指數(shù)輕微升高，與模型對照組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明附子注射液和雌二醇對子宮均有刺激作用，但附子注射液作用較雌二醇溫和，提示臨床用雌激素替代療法治療骨質疏松癥，有可能引起子宮組織增生而致瘤的風險。如能找到對子宮刺激作用較弱而又有效治療骨質疏松癥的藥物，就有可能使女性絕經(jīng)后骨質疏松癥的治療變得更安全、有效。

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Effects ofFuziInjection on Bone Metabolism and Bone Mineral Density in Ovariectomized Rats with Osteoporosis

PEI Yasong1，2，TANG Hanqing1，ZHENG Haofen2，SU Yonghua2，LI Xiaohua1

(1.SchoolofBasicMedicine,YoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，China；2.DepartmentofOrthopaedics,ChineseMedicalHospitalofQinzhouCity，GuangxiZhuangAutonmousRegion,Qinzhou535000，China)

Objective To observe effects offuziinjection on bone metabolism and bone mineral density (BMD) in ovariectomized rats with osteoporosis. Methods A total of 60 clean grade female Wistar rats were randomly divided into sham operation group，model control group，fuziinjection low-dose，middle-dose，high-dose group and positive control group with 10 rats in each group.Osteoporosis rat model was established in model control group，fuziinjecton groups and positive control group.Fuzi

fuziinjection (5，10 and 20 g·kg-1) and positive control group received positive control (0.05 g·kg-1) by intravenous injection once daily for 8 weeks.Sham operation group and model control group were intravenously injected with the same volume of normal saline once a day for 8 weeks.Levels of serum calcium and phosphorus，BMD，uterus index，Bone gla protein (BGP)，alkaline phosphatase (ALP)，creatinine (Cr)，deoxypyridinoline (DPD)，rabecular thickness and trabecular space were examined. Results Compared with the sham operation group，levels of serum calcium，phosphorus，urine levels of Ca/Cr，P/Cr，DPD/Cr and trabecular space in model control group significantly increased (P<0.05 orP<0.01)，while BMD，uterus index，BGP，ALP and trabecular thickness decreased significantly (P<0.01).Compared with the model control group，levels of serum calcium，phosphorus，urine levels of Ca/Cr，P/Cr，DPD/Cr and trabecular space in bothfuzigroup and positive control group decreased (P<0.05 orP<0.01)，while BMD，BGP，ALP and trabecular thickness increased significantly (P<0.01).Uterus index in positive control group increased significantly compared to the model control group (P<0.01). Conclusion Bothfuziand positive control injections can improve some biochemical indices of bone metabolism in osteoporosis.The uteral stimulation effect by high dosefuziinjection is lower than positive control and the mechanism needs further investigation.

Fuziinjection；Osteoporosis；Ovariectomy；Metabolism,bone

2013-09-20

2013-11-15

*廣西高等學校優(yōu)秀人才資助計劃(桂教人[2011]40號)

裴雅松(1976-)，男，廣西欽州人，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結合骨科臨床，電話：0777-2878569，E-mail：303682099@qq.com。

唐漢慶(1976-)，男，廣西合浦人，副教授，碩士生導師，博士，研究方向：民族醫(yī)藥研究及疾病的中西醫(yī)結合基礎研究。電話：0776-2849479，E-mail：phdtanghanqing@163.com。

R285；R965

A

1004-0781(2015)02-0185-05

DOI 10.3870/yydb.2015.02.011