間接免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗線粒體抗體的分析與比較

王 艷，劉曉輝，張學智，彭清林，王國春

（中日友好醫(yī)院 風濕免疫科，北京 100029）

抗線粒體抗體（antimitochondrial antibody，AMA）由Maokey 等于1958 年首次于原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者血清中發(fā)現(xiàn)， 是人體內一種無種屬特異性和器官特異性的自身抗體。 目前臨床上常用的檢測抗線粒體抗體的方法為間接免疫熒光法（IIF），其檢測的是總的抗線粒體抗體；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測的是與PBC 高度相關的AMA-M2 亞型。 理論上講，IIF 法和ELISA 法檢測的結果應該具有一致性，但臨床中經(jīng)常出現(xiàn)不一致的結果：ELISA 法測得AMA-M2 陽性，IIF 法測得AMA 陰性。 這常給臨床醫(yī)生對結締組織?。╟onnective tissue disease，CTD）的病情評估和診斷帶來一定的干擾。 因此，本文總結了2 種方法在實際臨床檢測中的相關性，以提高該抗體對臨床診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 觀察對象

選取2011 年1 月～2013 年6 月在我院門診及住院患者中， 使用2 種檢測方法：IIF 檢測AMA和ELISA 法檢測AMA-M2 且診斷明確的患者共726 例。 記錄患者的AMA 檢測結果及臨床診斷。檢測標本均為血清標本。

1.2 檢測方法

1.2.1 間接免疫熒光法（IIF 法）

采用Euroimmun 試劑盒檢測AMA，嚴格按試劑盒說明書操作。①加樣品：用樣品緩沖液將待檢血清按1：100 比例稀釋混勻，加25μl 標準品及稀釋好的血清于倒扣板上，蓋片，溫育30min。 ②加熒光標記的抗體：加入熒光標記的二抗體液25μl于倒扣板，蓋片，置30min。③用封片劑封片。④使用Olympus BX-51 熒光顯微鏡讀片。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA 法）

采用Euroimmun 試劑盒檢測血清AMA-M2水平并嚴格按試劑盒說明書操作。 ①加樣品：用樣品稀釋緩沖液將待檢血清按1：200 比例稀釋，分別將1～5 號標準品、 質控品及稀釋血清100pl加入用靶抗原包被的微孔中，溫育30min。②加酶標抗體：加入酶標二抗體液100ml，振蕩混勻后，置30min。③顯色反應：加入顯色劑各100ml，避光反應15min。④終止反應：加入終止液。⑤比色：將微孔板置于酶標儀上以450 nm 為主波長、630nm為副波長掃描測定各孔吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Excel 2007 和SPSS16.0 軟件處理測定數(shù)據(jù)。 IIF 和ELISA 法檢測抗線粒體抗體結果的一致性采用Kappa 檢驗。

2結果

2.1 抗線粒體抗體檢測結果

共計726 份標本，IIF 檢測AMA 陽性47 份，陽性率為6.5%；ELISA 檢測AMA-M2 陽性95份，陽性率為13.1% （表1）。 IIF 與ELISA 法檢測抗線粒體抗體結果的一致率為91.4%， 二者具有一致性（P＜0.05）。 不一致時，以IIF 法AMA 陰性同時ELISA 法AMA-M2 陽性多見（7.6%）。

表1 IIF 與ELISA 檢測抗線粒體抗體結果 n

表2 PBC 組與非PBC 組抗線粒體抗體分布n（%）

表3 AMA/AMA-M2 陽性患者的診斷n

2.2 IIF 與ELISA 診斷PBC 的準確率比較

以PBC 的臨床診斷為金標準，726 份標本中37 份（5.1%）確診PBC。 其他診斷為干燥綜合征、類風濕關節(jié)炎、 肌炎、 硬皮病等多種疾病。 IIF、ELISA 檢測對PBC 的確診率分別為90% 、91.04%。 IIF 診斷PBC 的敏感性為78.4%，特異性為97.4%；ELISA 診斷PBC 的敏感性和特異性分別為100%和91.6%（表2）。

2.3 AMA/AMA-M2 陽性患者的診斷（表3）

ELLISA 和IIF 檢測AMA 陽性 （AMA+/M2+）40 例：診斷PBC 29 例，占72.5%；其他CTD 7 例，占17.5%。 具體見表3。

2.4 AMA-/M2+組患者的數(shù)據(jù)分析

圖1 AMA-/M2+組中，AMA-M2 抗體在其他CTD 和PBC 中的抗體滴度

表3 示，AMA-/M2+組診斷為其他CTD 的35例患者中，干燥綜合征（SS）12 例（34.3%），系統(tǒng)性紅斑狼瘡6 例 （17.1%）。 女性29 例， 發(fā)病率82.8%；男性6 例，發(fā)病率17.1%。

其他CTD 組和PBC 組的AMA-M2 抗體濃度分布見圖1。 2 組間（54.9RU/ml vs 64.8RU/ml）無統(tǒng)計學差異（P=0.055）。

3 討論

正常人血清中無抗線粒體抗體存在。 一般多見于慢性肝炎、肝硬化患者和PBC 患者。 近年研究發(fā)現(xiàn)，AMA 也見于自身免疫病患者的血清中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等[1，2]。 AMA 的靶抗原是線粒體膜上的多種蛋白，成分復雜，現(xiàn)知有M1～M99 種成分。 其中，M2 亞型在臨床輔助疾病的診斷及病情評估中意義最大，文獻報道，AMAM2 見于90%的PBC 患者。 其診斷的靶抗原是線粒體內膜上的丙酮酸脫氫酶和α-酮酸脫氫酶的復合體， 是PBC 患者血清中AMA 反應的主要成分[3，4]。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風濕關節(jié)炎中檢測的抗體滴度通常較低[4]，以干燥綜合征（SS）最為常見，發(fā)生率高達47%～81%。有文獻報道，還在慢性丙型肝炎中發(fā)現(xiàn)AMA-M2 抗體[5]。本研究中，抗線粒體抗體陽性的患者CTD發(fā)病率很高，尤其是AMA-/M2+組患者， 診斷為CTD 比率最高，為63.6%。其AMA-M2 抗體滴度集中于28～89RU/ml之間。 因此，在無特征性臨床表現(xiàn)階段，如肝功能ALP、GGT 升高等，單獨的AMA-M2 陽性時，應結合其臨床癥狀和免疫學指標， 考慮是否為其他CTD 的可能性。CTD 中，以SS 常見，3 組診斷率分別為AMA-/M2+，21.8%；AMA+/M2+，12.5%；AMA+/M2-，14.3%。 PBC 的發(fā)病與自身免疫、病原微生物感染、接觸化學物品、遺傳、環(huán)境因素等有關[6]，這與CTD 極為相似。

PBC 診斷的一個很重要的抗體是AMA，并且它和疾病的病理變化有很大關系， 和AST 及肺的纖維化高度相關[7]，與PBC 的病期、疾病嚴重程度、治療效果均無相關性。 AMA-M2 亞型抗體見于90%的PBC 患者。 PBC 起病緩慢而隱匿，早期癥狀多不明顯或不典型，常伴有高強度的AMA[8]。然而當早期僅有ALP、GGP 升高， 且合并其他CTD 時，常常會用一源論多系統(tǒng)損害來解釋其肝損傷。 中晚期肝內及中等大小膽管的慢性淤膽性炎癥，膽管破壞和閉塞，纖維化，導致肝硬化甚至肝功能衰竭，最終死于各種并發(fā)癥[9]。

在很長一段時間被認為， 大約5%～10%被診斷為PBC 的患者，其AMA 是陰性的[8，10]。 本研究中，AMA-/M2+組，診斷為PBC 的患者多數(shù)歸類于AMA 陰性， 他們在肝臟B 超排除膽道阻塞情況下，行肝活檢病理檢查而確診。 雖然此種AMA 陰性的患者和抗體陽性的患者血清學指標有差異，但近年研究發(fā)現(xiàn)，這些患者的疾病進展過程，血清生化指標及肝臟組織學檢查， 都和AMA 陽性患者沒有明顯差異[11，12]。 并且，此類患者的抗核抗體和抗平滑肌抗體更多的出現(xiàn)陽性[3，13，14]。

在本組AMA/AMA-A2 陽性診斷PBC 的37例患者中，AMA 陰性8 例；無M2 陰性患者。 由于樣本數(shù)量的局限性， 不排除有M2 陰性患者診斷為PBC[10]。本研究顯示，針對醫(yī)院就診人群，ELISA檢 測AMA-M2 的 陽 性 率（13.1% ） 高 于IIF（6.5%），但二者結果基本一致。2 種方法檢測結果存在8.5%的不一致， 其中以IIF 法陰性同時ELISA 法AMA-M2 陽性多見（7.6%）。 2 種檢測方法診斷PBC 的準確率均在90%以上，說明都能較好的用于PBC 診斷。IIF 檢測雖然特異性較高，但敏感度只有78.4%；ELISA 雖然敏感性較高，但是特異性不如IIF。 因此，我們認為IIF 和ELISA 應同時進行，以增加診斷的敏感度和特異性。

上述2 種檢測AMA 的方法，其結果不一致，原因可能有以下幾種：（1）抗原遞呈給抗體的載體不同。 （2）抗體親和力不同。 IIF 陽性而ELISA 陰性， 則是因為AMA 成分復雜，M2 型抗原是其近百種亞型抗原中的一種。

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