缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷大鼠皮層Nrf2及HO-1表達(dá)變化的影響

疏龍飛 劉家傳 王金標(biāo) 張永明 張星 楊艷艷 馬濤 孫文江 卓健偉

·基礎(chǔ)研究·

缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷大鼠皮層Nrf2及HO-1表達(dá)變化的影響

疏龍飛 劉家傳 王金標(biāo) 張永明 張星 楊艷艷 馬濤 孫文江 卓健偉

目的研究缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷大鼠皮層核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶1(HO-1)表達(dá)變化的影響。方法216只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)、缺氧預(yù)處理組(HP)、顱腦損傷組(TBI)、缺氧預(yù)處理+顱腦損傷組(HP+TBI)；Con和HP組各12只，TBI和HP+TBI組根據(jù)傷后處死時(shí)間再分為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d八亞組，每組12只。采用改良的Feeney’s自由落體裝置制作顱腦損傷大鼠模型，先在低壓氧艙內(nèi)處理3 d(-50 kPa、3 h/d)制作缺氧預(yù)處理模型。四組均用免疫組化和Western blotting測(cè)定Nrf2、HO-1的表達(dá)變化。結(jié)果顱腦損傷后皮層Nrf2和HO-1在傷后1 h開始表達(dá)升高，24 h達(dá)高峰，3 d后下降，1 h～7 d各時(shí)間點(diǎn)，TBI與Con組、HP+TBI與HP組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單純3 d缺氧預(yù)處理后HP組與Con組比較，Nrf2、HO-1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；傷后1 h～7 d，HP+TBI組Nrf2、HO-1表達(dá)較TBI組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論缺氧預(yù)處理進(jìn)一步增加大鼠顱腦損傷后皮層Nrf2、HO-1表達(dá)，提高顱腦損傷后腦組織的抗氧化能力。

顱腦損傷；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2；血紅素加氧酶1；缺氧預(yù)處理

【Key words】Traumatic brain injury;Nuclear factor erythroid 2-related factor 2;Heme ox-ygenase-1;Hypoxic preconditioning

氧化應(yīng)激在顱腦損傷后繼發(fā)性病理改變中發(fā)揮了重要的作用，核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是脊椎動(dòng)物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子[1]，由Nrf2調(diào)節(jié)的Nrf2-ARE通路能誘導(dǎo)血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶(NADPH∶quinone oxidoreductase-1，NQO1)等多種抗氧化酶的表達(dá)；研究表明顱腦損傷后Nrf2-ARE通路激活增加[2]，參與損傷后的腦保護(hù)。通過(guò)建立缺氧預(yù)處理與自由落體顱腦損傷大鼠模型，探討缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷大鼠皮層Nrf2和HO-1表達(dá)變化的影響，為缺氧訓(xùn)練及顱腦損傷救治提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、器材和試劑

Feeney’s自由落體顱腦損傷模型(淮北正華生物科技公司)，WDZ-2000微型電動(dòng)手術(shù)電鉆(上海晶杰醫(yī)療器械有限公司)，低壓氧艙(上海減壓器廠)，VN-180活塞式無(wú)油真空泵(昆山佑誠(chéng)至信電機(jī)設(shè)備有限公司)，Nrf2兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，HO-1羊抗鼠多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)，RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，SP-9000抗兔二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，PV-9003抗羊二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

216只雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(Con組，n=12)、缺氧預(yù)處理(HP組，n= 12)、顱腦損傷(TBI組，n=96)、缺氧預(yù)處理+顱腦損傷組(HP+TBI組，n=96)。TBI組與HP+TBI組根據(jù)傷后不同時(shí)間點(diǎn)處死分為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d 8個(gè)亞組，每組12只。

三、模型制作及取材：

1.缺氧預(yù)處理模型制作：將大鼠放入低壓艙，熟悉環(huán)境5 min后，連接真空泵，緩慢減壓至﹣50 kPa(模擬5 500 m高度，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)大氣壓為0 kPa)，持續(xù)恒壓維持3 h后再緩慢升至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓出艙。HP與HP+TBI組連續(xù)預(yù)處理3 d，Con與TBI組不行缺氧預(yù)處理。

2.顱腦損傷模型制作：10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射將大鼠麻醉成功后，置于Feeney’s自由落體架，固定，消毒，沿頭皮中線矢狀切開頭皮，剝離左頂部骨膜，暴露顱骨，于前囟后3 mm中線左側(cè)旁開3 mm，緊靠冠狀縫后用微型電動(dòng)手術(shù)電鉆開一直徑5 mm的圓形骨窗，硬膜保持完整，50 g砝碼25 cm高度自由落下撞擊骨窗，打擊后骨蠟封閉骨窗，并行頭皮清創(chuàng)縫合術(shù)，保持大鼠呼吸道通暢，必要時(shí)給予心肺復(fù)蘇。TBI組只行顱腦打擊傷，HP+TBI組在連續(xù)3 d缺氧預(yù)處理結(jié)束1 d后行顱腦打擊傷，Con與HP組不行顱腦打擊傷。

3.取材：造模成功后，TBI和HP+TBI組再根據(jù)不同的分組時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，每一時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定，供大鼠免疫組化檢測(cè)使用。另各取6只大鼠挫傷區(qū)周圍新鮮標(biāo)本置于-80℃液氮罐中留做Western blotting分析用，Con組直接處死大鼠，HP組在連續(xù)3 d預(yù)處理結(jié)束后1 d處死大鼠，取相應(yīng)部位的皮層組織檢查，6只用于免疫組化，6只用于Western blotting檢測(cè)。

四、免疫組化檢測(cè)Nrf2和HO-1的表達(dá)

切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L(pH 6.0)枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，3%H2O2室溫20 min，10%正常羊血清封閉室溫20 min，加兔抗Nrf2(1∶100)，羊抗HO-1(1∶100)4℃過(guò)夜，PBS漂洗，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行，在高倍鏡(400倍)下隨機(jī)取損傷側(cè)皮層范圍內(nèi)5個(gè)非重疊視野，利用Iamge-Pro Plus6.0軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的光密度。

五、Western blotting檢測(cè)Nrf2和HO-1的表達(dá)

取各組大鼠損傷區(qū)周圍皮層大約100 mg置于玻璃勻漿器中，加入RIPA細(xì)胞裂解液，充分碾磨，12 000×g離心5 min，收集上清液提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。按蛋白與緩沖液以1∶4比例混勻后煮沸5 min使之變性，冷卻后取10 μg上樣，β-actin作為內(nèi)參。β-actin、Nrf2和HO-1的抗體均按1∶1 000稀釋，二抗按1∶10 000稀釋。用Quantity one4.6.2軟件測(cè)定各條帶積分灰度值,以目的條帶與β-actin條帶灰度值之比作為蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。

圖1 各組大鼠皮層中Nrf2表達(dá)的染色(DAB,×400)

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。Nrf2光密度、HO-1光密度等數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，不同組間兩樣本的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、免疫組化染色測(cè)定Nrf2和HO-1的分布與表達(dá)

光鏡下可見顱腦損傷1 h后膠質(zhì)細(xì)胞開始腫脹，毛細(xì)血管擴(kuò)張、破裂，血管及細(xì)胞周圍間隙擴(kuò)大伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨時(shí)間推移部分神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)變少成空泡狀，胞核濃縮，傷后7 d可見神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中大量空泡形成。在顱腦損傷前Nrf2、HO-1少量分布于大鼠神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，隨顱腦損傷時(shí)間的推移，Nrf2和HO-1的平均光密度在傷后1 h開始升高，24 h達(dá)高峰，3 d后開始下降；傷后1 h～7 d，TBI組與Con組、HP+TBI組與HP組各時(shí)間點(diǎn)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；HP+TBI組與TBI組各時(shí)間點(diǎn)比較，傷后1 h～7 d Nrf2和HO-1的平均光密度更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，HP組與Con組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖1～2)。

二、Western blotting測(cè)定皮層中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)

Nrf2各組電泳顯示在56～58 kD范圍的條帶，HO-1各組電泳顯示在31～33 kD范圍的條帶；Nrf2和HO-1在顱腦損傷后1 h開始升高，24 h達(dá)高峰，3 d后開始下降；傷后1 h～7 d各時(shí)間點(diǎn)，TBI組與Con組、HP+TBI組與HP組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；傷后1 h～7 d各時(shí)間點(diǎn)，HP+TBI組將TBI組Nrf2和HO-1的表達(dá)進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，Con組與HP組相比，Nrf2和HO-1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖3、4)。

表1 各組大鼠皮層中Nrf2、HO-1免疫組化平均光密度比較(

表1 各組大鼠皮層中Nrf2、HO-1免疫組化平均光密度比較(

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與未缺氧組比較，bP＜0.05

對(duì)照組傷后1 h 傷后3 h 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后3 d 傷后7 d 傷后14 d F值P值例數(shù)666666666未缺氧31.6400.000 Nrf2光密度缺氧預(yù)處理41.6720.000未缺氧30.1320.000 HO-1光密度缺氧預(yù)處理0.134± 0.024 0.141± 0.023 0.144± 0.025 0.149± 0.029 0.170± 0.031a0.219± 0.026ab0.177± 0.026a0.216± 0.031ab0.187± 0.034a0.265± 0.030ab0.207± 0.032a0.250± 0.035ab0.227± 0.018a0.309± 0.047ab0.252± 0.045a0.325± 0.049ab0.266± 0.036a0.356± 0.029aba0.304± 0.041a0.374± 0.049ab0.330± 0.035a0.450± 0.037ab0.371± 0.037a0.447± 0.045ab0.224± 0.028a0.303± 0.056ab0.260± 0.031a0.326± 0.050ab0.152± 0.025a0.215± 0.040ab0.186± 0.034a0.234± 0.035ab0.136± 0.018a0.165± 0.032 0.147± 0.029 0.162± 0.01638.5150.000

圖2 各組皮層中HO-1表達(dá)的染色(DAB,×400)

圖3 Nrf2、HO-1在Con與TBI組蛋白的表達(dá)

圖4 Nrf2、HO-1在HP與HP+TBI組蛋白的表達(dá)

討論

Nrf2-ARE通路是啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化保護(hù)機(jī)制的主要通路[1]，當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中與起始反應(yīng)元件ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化蛋白HO-1、NOQ1，Grx，TrxR等表達(dá)參與抵抗損傷。給予短暫的預(yù)處理，能夠增加機(jī)體對(duì)隨后嚴(yán)重致死性刺激的耐受[3]，缺氧預(yù)處理是研究較多的一種預(yù)處理方法，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧預(yù)處理能夠?qū)9c2細(xì)胞產(chǎn)生一種延遲的保護(hù)作用[4]，這種保護(hù)作用是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中Nrf2依賴的抗氧化通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。顱腦損傷后Nrf2-ARE通路表達(dá)激活[2]，前期我們的研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理通過(guò)上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)對(duì)顱腦損傷后的神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用[5]，但缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷后的抗氧化酶動(dòng)態(tài)表達(dá)影響尚不清楚。因此研究缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷后Nrf2和HO-1表達(dá)變化可進(jìn)一步觀察缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷的作用機(jī)制。

表2 各組大鼠皮層中Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量比較

表2 各組大鼠皮層中Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與未缺氧組比較，bP＜0.05

對(duì)照組傷后1 h 傷后3 h 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后3 d 傷后7 d 傷后14 d F值P值例數(shù)666666666未缺氧82.2040.000 Nrf2/ β-actin 缺氧預(yù)處理110.88 80.000 HO-1/ β-actin未缺氧73.2210.000缺氧預(yù)處理0.223± 0.028 0.247± 0.048 0.239± 0.036 0.261± 0.029 0.309± 0.019a0.367± 0.041ab0.320± 0.030a0.422± 0.040ab0.387± 0.029a0.512± 0.039ab0.406± 0.028a0.529± 0.061ab0.520± 0.029a0.647± 0.031ab0.532± 0.039a0.648± 0.050ab0.667± 0.047a0.834± 0.051ab0.657± 0.049a0.792± 0.066ab0.771± 0.069a1.051± 0.112ab0.806± 0.042a1.016± 0.093ab0.466± 0.031a0.603± 0.053ab0.516± 0.046a0.716± 0.083ab0.334± 0.034a0.389± 0.072ab0.363± 0.040a0.487± 0.063ab0.219± 0.014 0.224± 0.032 0.244± 0.036 0.277± 0.04947.3240.000

本實(shí)驗(yàn)中大鼠進(jìn)行顱腦打擊傷后，挫傷區(qū)周圍皮層Nrf2和HO-1在傷后1 h開始表達(dá)增多，24 h達(dá)高峰，3 d后開始下降，直至傷后第7 d，TBI組與Con組相比，Nrf2和HO-1的表達(dá)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示出Nrf2和HO-1作為一種急性應(yīng)激蛋白在顱腦損傷后激活增多，參與繼發(fā)性顱腦損傷早期的病理改變過(guò)程。給予大鼠連續(xù)3 d短暫的缺氧預(yù)處理，1 d后再行顱腦打擊傷，顯示缺氧預(yù)處理進(jìn)一步激發(fā)了大鼠顱腦損傷后皮層抗氧化酶的表達(dá)，這種激發(fā)作用在顱腦損傷后1 h就開始顯現(xiàn)出來(lái)，持續(xù)至傷后第7 d，并且與顱腦損傷后Nrf2和HO-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1 h～7 d)的時(shí)間窗相一致，顯示出短暫連續(xù)的缺氧預(yù)處理通過(guò)提高顱腦損傷后抗氧化酶的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用在繼發(fā)性顱腦損傷相對(duì)明顯的時(shí)間窗內(nèi)都表現(xiàn)出來(lái)。這種短暫的3 d缺氧預(yù)處理對(duì)正常大鼠的皮層抗氧化酶的表達(dá)并無(wú)明顯的影響，其激活腦組織的保護(hù)機(jī)制在受到一個(gè)更加嚴(yán)重刺激時(shí)才會(huì)顯示出來(lái)。對(duì)于Nrf2調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)機(jī)制，通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷前Nrf2少量分布在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，顱腦損傷后隨時(shí)間的推移，胞質(zhì)染色逐漸變深，顯示出了Nrf2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的過(guò)程，這與Nrf2調(diào)控的基因表達(dá)方式相符[6]。

除了顱腦損傷中證實(shí)Nrf2-ARE被激活外，其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激中疾病中也發(fā)現(xiàn)了Nrf2-ARE通路能夠發(fā)揮保護(hù)作用[7-9]。Nrf2作為一種重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控的一系列抗氧化酶在機(jī)體內(nèi)組成一個(gè)強(qiáng)大的防御體系。本實(shí)驗(yàn)制作了大鼠缺氧預(yù)處理模型，來(lái)研究激活Nrf2-ARE通路的可行性方案，相對(duì)于其他預(yù)處理方式，缺氧預(yù)處理具有安全，可操作，可重復(fù)性，HP組的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了短暫的缺氧處理對(duì)皮層Nrf2和HO-1的表達(dá)無(wú)影響，但缺氧預(yù)處理也有一些缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中選擇在連續(xù)3 d缺氧結(jié)束后1 d進(jìn)行顱腦打擊傷，顯示出缺氧預(yù)處理對(duì)皮層的保護(hù)作用，但預(yù)處理結(jié)束后超過(guò)一定的時(shí)間窗其保護(hù)保護(hù)效果可能就會(huì)消失；另外個(gè)體間存在一點(diǎn)的差異，同一預(yù)處理?xiàng)l件下，機(jī)體的耐受性可能也不相同。

本實(shí)驗(yàn)從氧化應(yīng)激的角度研究了缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷后抗氧化酶的表達(dá)影響，短暫的缺氧預(yù)處理提高了顱腦損傷大鼠皮層腦組織Nrf2、HO-1抗氧化酶的表達(dá)，增加了顱腦損傷后腦組織抗氧化應(yīng)激的能力，因此從事一些高原及重大危險(xiǎn)的工作時(shí)，事先進(jìn)行短暫缺氧訓(xùn)練，通過(guò)激發(fā)機(jī)體抵抗外界的不利刺激的潛力，提高自我防范風(fēng)險(xiǎn)的能力。

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Expression changes of Nrf2 and HO-1 in rat cortex following traumatic brain injury after hypoxic preconditioning

Shu Lon gfei,L iu Jiachuan,Wang Jinb iao,Zhang Yon gmin g,Zhang Xin g,Yang Yanyan,Ma Tao,Sun Wenjiang,Z huo Jianwei.
Department of Neurosurgery,the No.105 Hospital of PLA,Hefei,Anhui 230031,China

Liu Jiachuan,Email:ljc571017@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression changes of nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)and heme oxygenase-1(HO-1)in rat cortex following traumatic brain injury after hypoxic preconditioning.MethodsTwo hundred and sixteen adult male Sprague Dawley rats were randomly divided into control group(Con),hypoxic preconditioning group(HP),traumatic brain injury group(TBI)and hypoxic preconditioning+traumatic brain injury group(HP+TBI).Con and TBI groups had 12 rats respectively,TBI or HP+TBI group was subdivided into 8 groups according to sacrifice time points,namely group 1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,3 d,7 d and 14d(n=12).TBI models were made by the Feeney’s improved equipment and hypoxic preconditioning models were made by Hypobaric chamber for 3 days(-50kPa、3 h/d).The expression of Nrf2 and HO-1 in the brain cortex was detected by immunohistochemistry and western blotting.ResultsThe expression of Nrf2 and HO-1 began to increase at 1 h, reached the peak at 24 h,and decreased slowly at 3 d after TBI.At the time points of 1 h to 7 d,the expression of Nrf2 and HO-1 in the HP+TBI or TBI group was significantly higher than those in the Con or HP group(p＜0.05).After consecutive three days hypoxic preconditioning,the expression of Nrf2 and HO-1 had no significant difference between HP and Con groups,but the expression of Nrf2 and HO-1 in the HP+TBI group was higher than those in the TBI group from 1 h to 7 d(p＜0.05).ConclusionHypoxic preconditioning up-regulates the expression of Nrf2 and HO-1 in the brain cortex,which enhances the anti-oxidative ability of brain after TBI.

2015-07-07)

(本文編輯：楊藝)

DOI∶10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.04.009

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目(面上)(CWS11J262);2009年度南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)課題(09Z009)

23003l合肥，解放軍第105醫(yī)院神經(jīng)外科

劉家傳，Email：ljc571017@sina.com

疏龍飛,劉家傳,王金標(biāo),等.缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦損傷大鼠皮層Nrf2、HO-1表達(dá)變化的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(4)∶227-231.