電針對(duì)大鼠脊髓損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響

楊 波 隋汝波

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

電針對(duì)大鼠脊髓損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響

楊 波 隋汝波

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

目的 探討電針干預(yù)大鼠脊髓損傷(SCI)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas、腫瘤壞死因子受體(TNFR)1蛋白表達(dá)的影響。方法 隨機(jī)將大鼠分為模型組、空白對(duì)照組、西藥組、電針組，采用改良式的Allen打擊法制備SCI模型，并分別于脊髓損傷后不同時(shí)段(6 h、1、7 d)進(jìn)行取材，檢測(cè)損傷脊髓組織內(nèi)Fas、TNFR1的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，西藥組和電針組Fas、TNFR1表達(dá)水平均下降(P<0.05)；電針組與西藥組效果相當(dāng)(P>0.05)。結(jié)論 電針治療SCI可能是通過降低損傷脊髓中的Fas、TNFR1的表達(dá)水平，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡進(jìn)程、促進(jìn)脊髓組織損傷的恢復(fù)等來實(shí)現(xiàn)的。

電針；脊髓損傷；細(xì)胞凋亡；Fas；腫瘤壞死因子受體(TNFR)1

脊髓損傷(SCI)總發(fā)生率每年(20～40)/百萬〔1～3〕，多發(fā)生在青壯年(男性約占82%)。美國(guó)每年有10 000新發(fā)病例，發(fā)生SCI的患者中截癱人數(shù)甚至達(dá)到250萬人〔4〕。有報(bào)道曾指出，早期給予SCI患者電針治療，相對(duì)程度上能夠降低患者的繼發(fā)損傷，局部的少量電場(chǎng)在某種意義上還可以加速機(jī)體軸突的再生及恢復(fù)〔5〕，后期給予電刺激治療，可降低SCI并發(fā)癥，改善并促進(jìn)患者功能狀況的盡快恢復(fù)。故目前認(rèn)為SCI后應(yīng)盡可能早地采用電針治療。SCI損傷后激發(fā)損傷的重要原因?yàn)橹卵滓蜃拥钠茐淖饔?。本課題擬探討SCI的機(jī)制和電針干預(yù)SCI對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇Wistar大鼠，體重200～250 g，雄性，清潔級(jí)，共計(jì)60只，由本省動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。動(dòng)物常溫下自由飲水及攝食。適應(yīng)1 w后將其隨機(jī)分為模型組、空白對(duì)照組、西藥組、電針組，每組15只。

1.2 方法 建模：采用改良式的Allen打擊法進(jìn)行胸10節(jié)段SCI模型的制備。其中：電針組造模后進(jìn)行試驗(yàn)，并選取“命門”、“大椎”部位進(jìn)針0.6 cm左右，采用成都千里電子設(shè)備有限公司ZP-100系列低頻電療儀進(jìn)行電針刺激，其中頻率為20 Hz，強(qiáng)度為 2 mA，時(shí)間設(shè)定為持續(xù)20 min。1次/d，同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。西藥組造模后立即尾部給予甲潑尼龍靜脈注射，劑量為25 mg/kg，第二天同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行第二次注射，劑量為5 mg/kg。模型組、空白對(duì)照組制備模型成功后不給予治療，僅在上述兩組治療時(shí)給予抓取束縛干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo) 采用DAB免疫組化檢測(cè)損傷脊髓組織內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas、腫瘤壞死因子受體(TNFR)1蛋白表達(dá)水平：取造模后6 h，1、7 d的模型組、空白對(duì)照組、西藥組、電針組大鼠，深度麻醉。給予開胸術(shù)，灌注心臟并放置固定液中進(jìn)行固定。后以損傷部位為中心迅速剪下長(zhǎng)為1 cm左右的脊髓，同樣固定。上述組織均給予沖洗、梯度洗脫、制蠟片過程。 切片光鏡下觀察。脊髓橫斷面切片40倍物鏡下采集圖像。每個(gè)時(shí)間段測(cè)3個(gè)片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組組織病理學(xué)結(jié)果 造模后第1天，造模大鼠脊髓損傷區(qū)可見大量出血，且出血帶周圍發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元出現(xiàn)壞死，并伴有神經(jīng)纖維的溶解，甚至消失，7 d后脊髓損傷區(qū)末端灰質(zhì)及白質(zhì)位置無出血，但能夠觀察到有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死現(xiàn)象(圖1)。提示造模成功。

圖1 模型組脊髓橫斷面(d=100 μm)

2.2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas蛋白的表達(dá) 模型組Fas陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的表達(dá)較高，在損傷早期(1 h)時(shí)尤為明顯，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，并在脊髓灰、白質(zhì)中均有分布?？瞻讓?duì)照組中有極少表達(dá)；西藥組、電針組僅有少量表達(dá)。見圖2。其中，與空白對(duì)照組比較，模型組、西藥組、電針組術(shù)后6 h、1、7 d均有所升高(P<0.05或P<0.01)，模型組最為明顯。見表1、圖2。

表1 各組Fas蛋白的表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05；與同組內(nèi)術(shù)后1 d比較：4)P<0.05；下表同

圖2 各組細(xì)胞Fas蛋白的免疫組織化學(xué)切片(×40)

2.3 各組TNFR1蛋白的表達(dá) 模型組TNFR1陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的表達(dá)較高，在損傷早期(1 h)時(shí)尤為明顯，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，并在脊髓灰、白質(zhì)中均有分布?？瞻讓?duì)照組中有極少表達(dá)；西藥組、電針組僅有少量表達(dá)。見圖3。其中，與空白對(duì)照組比較，模型組、西藥組、電針組術(shù)后6 h、1、7 d均有所升高(P<0.05或P<0.01)，模型組最為明顯。見表2、圖3。

圖3 各組TNFR1蛋白的免疫組織化學(xué)切片(×40)

組別術(shù)后6h術(shù)后1d術(shù)后7d空白對(duì)照組465 8±29 3466 3±22 1465 7±22 2模型組1038 8±26 42)4)1910 7±23 92)1290 6±20 82)4)西藥組633 6±25 81)3)4)820 7±27 01)3)600 5±28 21)3)4)電針組655 5±26 21)3)4)828 7±25 51)3)618 6±28 41)3)4)

3 討 論

SCI往往會(huì)伴有傷情嚴(yán)重復(fù)雜，多發(fā)傷、復(fù)合傷較多，并發(fā)癥多，合并脊髓傷時(shí)預(yù)后差，甚至造成終生殘疾或危及生命〔6〕，目前已掀起了各國(guó)學(xué)者對(duì)SCI修復(fù)研究的又一次熱潮〔7～9〕。目前仍然沒有一種方法能夠完全治愈SCI后所造成的后遺癥。

傳統(tǒng)的外科手術(shù)減壓，往往從整體出發(fā)，通過整復(fù)骨折部位來降低或減緩對(duì)脊髓的病理壓迫，盡早恢復(fù)受損脊髓，但該療法對(duì)脊髓的原發(fā)性損傷效果不明顯，且針對(duì)手術(shù)來進(jìn)行減壓的治療手段也存在一定的爭(zhēng)議。手術(shù)入路在一定程度上要求操作者要完全熟知椎體損傷的類型及對(duì)手術(shù)部位的熟悉，由于SCI患者較多的是高位癱瘓，并伴有明顯的心肺功能及多器官的損傷，手術(shù)減壓治療能否會(huì)影響損傷并發(fā)癥的發(fā)生報(bào)道較少。藥物治療也可作為SCI治療的一種方法，且有報(bào)道顯示，美國(guó)急性脊髓損傷研究會(huì)(NASCIS)發(fā)表聲明，指出藥物治療SCI的黃金時(shí)期為8 h內(nèi)〔10〕。甲潑尼龍作為人工合成的糖皮質(zhì)激素中的典型代表，是一種中效制劑，因其較強(qiáng)的抗炎作用而被廣泛應(yīng)用于臨床〔11〕。目前關(guān)于其較為重要的作用機(jī)制研究數(shù)據(jù)主要來源于NASCIS，總結(jié)如下：①降低SCI患者機(jī)體的水腫程度；②擴(kuò)大血管通道，促進(jìn)血液流通，改善損傷機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；③阻止炎癥反應(yīng)及過氧化反應(yīng)的進(jìn)程，減輕外界對(duì)細(xì)胞的刺激及損傷；④清除并降低自由基水平，降低并減少損傷脊髓處兒茶酚的堆積。

電場(chǎng)也可能會(huì)參與神經(jīng)生長(zhǎng)的走向過程，并降低損傷神經(jīng)的病變程度。電刺激有三種電場(chǎng)，分別為脈沖電磁場(chǎng)、直流電場(chǎng)、外置電場(chǎng)〔12～15〕。Fehlings等〔16〕較早對(duì)SCI大鼠給予直流電電場(chǎng)治療，發(fā)現(xiàn)其脊髓的軸突能夠在電場(chǎng)的刺激下再生。電針抗SCI已有諸多的實(shí)驗(yàn)和臨床報(bào)道〔17～20〕，結(jié)果表明電針可以阻止或減輕SCI后的繼發(fā)性的損害，促進(jìn)脊髓的修復(fù)和再生。

綜上，電針治療SCI可能是通過降低損傷脊髓中的Fas、TNFR1的表達(dá)水平，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡進(jìn)程、促進(jìn)脊髓組織損傷的恢復(fù)。

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〔2014-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(No.L2012311)

楊 波(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)疾病研究。

R245.97

A

1005-9202(2015)12-3263-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.034