王 丹 李 紅 白云生 于春艷 陳立梅 孫紅霞
(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 吉林 132001)
尾加壓素Ⅱ?qū)δI間質(zhì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用及其機(jī)制
王 丹 李 紅1白云生1于春艷 陳立梅 孫紅霞
(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 吉林 132001)
目的 探討尾加壓素Ⅱ(UⅡ)對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞促增殖作用及其機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)大鼠NRK-49F細(xì)胞,采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MT)法、流式細(xì)胞儀(FCM)法分別觀察不同濃度UⅡ作用下,NRK-49F細(xì)胞數(shù)及其細(xì)胞周期的變化。RT-PCR法檢測(cè)UⅡ組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)。結(jié)果 UⅡ可以促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞的增殖活性,隨著UⅡ作用濃度的增加,MTT吸光度值呈先升高后降低的趨勢(shì),其中1×10-9和1×10-8mol/L UⅡ組作用顯著(P<0.01);在UⅡ的作用下,NRK-49F細(xì)胞 S 期細(xì)胞百分率較對(duì)照組明顯增加,而G0~G1期細(xì)胞百分率較對(duì)照組明顯降低(P<0.01);細(xì)胞培養(yǎng)24 h后正常對(duì)照組胞質(zhì)中僅見(jiàn)少量TGF-β1的表達(dá),而經(jīng)UⅡ作用后,TGF-β1的表達(dá)明顯增多。結(jié)論 UⅡ能促進(jìn)大鼠NRK-49F細(xì)胞增殖,影響細(xì)胞周期,這可能與致纖維化因子TGF-β1的提高有關(guān),提示UⅡ在腎纖維化發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
尾加壓素Ⅱ;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;增殖;細(xì)胞周期
腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化多發(fā)生于中老年患者,是老年人腎臟的特征性改變。尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是一種生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽,具有強(qiáng)烈的縮血管效應(yīng)〔1〕,縮血管效應(yīng)是內(nèi)皮素(ET)-1的10倍多〔2〕。近年國(guó)內(nèi)外的研究相繼發(fā)現(xiàn)UⅡ并非僅有血流動(dòng)力學(xué)作用,其在腎臟的高表達(dá)可能有重要的意義〔3〕。但UⅡ?qū)δI間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制尚不清楚。本研究觀察了UⅡ?qū)Υ笫竽I成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響,及其對(duì)致纖維化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1分泌的影響,探討UⅡ在腎間質(zhì)纖維化中可能發(fā)生的作用及其相關(guān)機(jī)制。
1.1 主要試劑 NRK-49F細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù),DMEM培養(yǎng)基(Gibco),標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司),UⅡ(Sigma),PCR引物,上海生工生物技術(shù)公司。
1.2 大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞NRK-49F培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng),生長(zhǎng)至70%~80%匯合時(shí)吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗培養(yǎng)瓶,加入0.25%胰酶消化液,37℃消化。消化后加入培養(yǎng)基,并吹打細(xì)胞,將細(xì)胞懸液,分裝后繼續(xù)培養(yǎng)。
1.3 細(xì)胞增殖的測(cè)定 NRK-49F細(xì)胞增殖應(yīng)用四甲偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定。將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%胰酶消化,制成細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,加無(wú)血清培養(yǎng)液37℃孵育同步化24 h 后,棄上清液,加入含不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol/L)10%小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,對(duì)照組和處理組均重復(fù)3次。于刺激結(jié)束前4 h加入MTT 20 μl/孔(5 g/L),37℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),吸棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩混勻10 min 后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值,用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。
1.4 細(xì)胞周期測(cè)定 常規(guī)消化分組處理,UⅡ組及UⅡ活性阻斷組,收集后用PBS 洗2次,固定于75%預(yù)冷乙醇中,4℃過(guò)夜。1 000 r/min離心5 min,吸除乙醇,PBS 洗2次。懸浮于150 μl PBS 中,再加入適量RNase(1 mg/ml),37℃水浴30 min后,除去RNA,加碘化丙啶至50 μl/ml,避光顯色10 min 上機(jī), 用CEL-LQest 軟件分析細(xì)胞周期。
1.5 RT-PCR法檢測(cè)UⅡ抗體對(duì)UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 常規(guī)消化分組處理,UⅡ組(10-8mol/L);UⅡ活性阻斷抗體組:10-5mol/L UⅡ抗體預(yù)處理60 min后,加入10-8mol/L UⅡ培養(yǎng)24 h;培養(yǎng)細(xì)胞24 h后棄去上清, PBS沖洗,加入TRIzol反復(fù)吹打,移入EP管,提取細(xì)胞總RNA??俁NA提取后,用紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm/280 nm的紫外吸收值,重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果各組A260/A280在1.8~2.0之間,說(shuō)明所提取的RNA純度高。RNA溶于無(wú)水乙醇,置于-20℃冰箱保存。以mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物的光密度值與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物光密度值的比值,作為目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)值。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,引物序列用Primer 3軟件設(shè)計(jì)。正義:5'-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3',反義:5'-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3'。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0軟件行方差分析。
2.1 UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng) NRK-49F細(xì)胞經(jīng)不同濃度UⅡ刺激24 h后,應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)A490值, NRK-49F細(xì)胞的吸光度值呈濃度依賴性增加趨勢(shì),其中1×10-9mol/L和1×10-8mol/L兩個(gè)濃度組(0.610±0.014,0.622±0.085)較對(duì)照組(0.529±0.010)明顯升高(P<0.05,P<0.01)。表明在1×10-10~1×10-7mol/L的濃度范圍內(nèi),UⅡ以濃度依賴方式促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞增殖,其中以1×10-8mol/L UⅡ的作用最明顯。另外1×10-10mol/L吸光度值為0.545±0.019,1×10-7mol/L為0.566±0.032。
2.2 UⅡ?qū)RK-49F細(xì)胞周期的影響 UⅡ抗體、尼莫地平同單純用UⅡ組比較,均能降低NRK-49F細(xì)胞S期百分比,其中UⅡ抗體組同UⅡ組比較具有明顯差異(P<0.01),見(jiàn)表1。
表1 各組NRK-49F細(xì)胞周期比較
與對(duì)照組比較:1)P<0.01;與1×10-8mol/L UⅡ組比較:2)P<0.01
2.3 UⅡ抗體、尼莫地平對(duì)UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞致纖維化因子TGF-β1表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)照組NRK-49F細(xì)胞有少量TGF-β1 mRNA(1.091±0.065)表達(dá),加入U(xiǎn)Ⅱ(1×10-8mol/L)后TGF-β1 mRNA表達(dá)(1.604±0.081)顯著增加(P<0.01),UⅡ抗體和尼莫地平均能部分降低NRK-49F細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá),但未能完全阻斷,其表達(dá)量仍高于對(duì)照組(P<0.05)。其中UⅡ抗體TGF-β1 mRNA表達(dá)(1.202±0.094),尼莫地平組表達(dá)1.233±0.039,1×10-8mol/L UⅡ組表達(dá)1.272±0.073。見(jiàn)圖1。
1~4:對(duì)照組、1×10-8 mol/L UⅡ組、UⅡ抗體組、尼莫地平組
腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路,是導(dǎo)致慢性腎衰竭的病理學(xué)基礎(chǔ),其發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展中TGF-β是研究得較為透徹的致病因子之一。作為一種強(qiáng)效的致纖維化因子,TGF-β過(guò)度生成或活性升高與多種原因引起的腎纖維化密切相關(guān),是腎臟纖維化過(guò)程中的最終調(diào)節(jié)因子。
UⅡ不僅具有縮血管效應(yīng),還是體內(nèi)重要的促有絲分裂原,能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖〔4〕,研究發(fā)現(xiàn),UⅡ?qū)θ槭竽I小球系膜細(xì)胞具有誘導(dǎo)作用〔5〕,提示了UⅡ可能參與糖尿病腎病系膜細(xì)胞的增殖發(fā)病學(xué)。UⅡ及其受體在腎臟有豐富表達(dá)〔6〕。在健康人腎臟UⅡ主要存在于腎小管和集合管上皮細(xì)胞,尤其是遠(yuǎn)曲小管。這些可能意味著UⅡ在腎臟功能調(diào)節(jié)中有著重要的作用。
近年研究顯示〔7〕,UⅡ能協(xié)同異丙腎上腺素所致心肌肥大和心肌纖維化過(guò)程,促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展,這與本文研究UⅡ在腎間質(zhì)纖維化中的作用較為相似。本研究結(jié)果表明,UⅡ促進(jìn)TGF-β1致纖維化因子的表達(dá),而且此作用可被UⅡ抗體及鈣通道阻斷劑所抑制。UⅡ與其受體結(jié)合,從而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng),如刺激產(chǎn)生和分泌TGF-β,促進(jìn)細(xì)胞增殖,增加ECM合成和分泌,從而加速腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程,加重腎功能損害,即UⅡ通過(guò)腎臟細(xì)胞的自分泌或旁分泌作用參與纖維化病理過(guò)程,在腎間質(zhì)纖維化病變的發(fā)生機(jī)制中,UⅡ可能是一個(gè)引起腎小管損傷和纖維化形成的新的重要致病因子。UⅡ具有促TGF-β生成作用,但UⅡ與TGF-β的具體分子關(guān)系如何,UⅡ是否是腎間質(zhì)纖維化的始動(dòng)因素之一,還是二者協(xié)同起作用,這是值得進(jìn)一步深入研究的課題。
UⅡ功能抑制劑或受體拮抗劑可能會(huì)有助于闡明UⅡ在腎臟疾病中的生物學(xué)作用。Palosuran是一個(gè)有效的人UⅡ特異性拮抗劑〔8〕,可以呈濃度依賴性抑制UⅡ誘導(dǎo)的大鼠大動(dòng)脈環(huán)的收縮,能競(jìng)爭(zhēng)性作用于UⅡ。最近報(bào)道,Palosuran能延緩腎臟損傷的進(jìn)展。然而,在終末期腎衰透析患者,UⅡ發(fā)揮心肌保護(hù)作用〔9〕,血清UⅡ濃度高的患者發(fā)生心血管意外的危險(xiǎn)性低,推測(cè)是由UⅡ影響了交感神經(jīng)活性以及一氧化氮系統(tǒng)而引起的。因此,UⅡ受體選擇性拮抗劑是否能廣泛應(yīng)用于臨床,其適應(yīng)證、具體用藥時(shí)間等,還需要做進(jìn)一步探討。
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〔2014-10-25修回〕
(編輯 袁左鳴/滕欣航)
吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目 (2012144)
王 丹(1975-),女,副教授,博士,主要從事腎臟病理學(xué)研究。
R692.32
A
1005-9202(2015)12-3261-02;
10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.033
1 吉化總醫(yī)院急診科