VEGF對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞株功能的影響及相關(guān)機(jī)制

高 靜 朱紅霞 王敏哲 茍 靜 張 麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830011)

VEGF對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞株功能的影響及相關(guān)機(jī)制

高 靜 朱紅霞 王敏哲 茍 靜 張 麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)株增殖及凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)的VSMCs細(xì)胞株采用0、0.1、0.2和0.4 μg/ml的VEGF及0.4 μg/ml的VEGF處理體外培養(yǎng)的VSMCs細(xì)胞株0、24、48、72 h，采用Western印跡方法檢測(cè)VSMCs細(xì)胞株中磷脂酶C(PLC)-γ1信號(hào)通路的磷酸化活化情況，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)和流式細(xì)胞儀(FCM)方法檢測(cè)VSMCs細(xì)胞株增殖和凋亡能力的變化情況。采用PLC-γ1信號(hào)通路抑制劑U71322阻斷VSMCs細(xì)胞株中PLC-γ1信號(hào)通路后，再以VEGF處理VSMCs細(xì)胞株，MTT和FCM方法檢測(cè)VSMCs細(xì)胞株增殖和凋亡能力的變化情況。結(jié)果 同0 μg/ml 的VEGF處理組相比，0.1、0.2、0.4 μg/ml的VEGF可顯著加強(qiáng)VSMCs細(xì)胞株的增殖能力(P<0.01)，并抑制VSMCs細(xì)胞株的凋亡水平(P<0.01)，且這種作用具有計(jì)量依賴性。Western印跡結(jié)果顯示，0.1 μg/ml的VEGF處理即可顯著活化VSMCs細(xì)胞株中的PLC-γ1信號(hào)通路，且隨著VEGF處理濃度的升高，PLC-γ1信號(hào)通路活化水平逐漸升高。當(dāng)采用U71322阻斷VSMCs細(xì)胞株中的PLC-γ1信號(hào)通路后，VEGF促VSMCs細(xì)胞株增殖的能力，以及抑制VSMCs細(xì)胞株的凋亡能力均顯著降低(P<0.01)。結(jié)論 VEGF可通過活化PLC-γ1信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)VSMCs細(xì)胞株的增殖能力，并抑制VSMCs細(xì)胞株的凋亡水平。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血管平滑肌細(xì)胞；增殖；凋亡；信號(hào)通路

糖尿病患者常伴有大血管病變與微血管病變，嚴(yán)重?fù)p害患者心、腦、腎和視網(wǎng)膜等重要靶器官的功能〔1〕。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是冠心病和糖尿病共同的病理基礎(chǔ)〔2〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是高度保守的同源二聚體糖蛋白，在維持血管內(nèi)皮的完整性和功能調(diào)控方面具有重要的作用；此外，VEGF還參與新生血管生成的調(diào)控〔3〕。研究顯示，VEGF與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，VEGF可通過調(diào)控新生血管生成和炎癥因子表達(dá)而參與AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展和失穩(wěn)定性〔4〕。同時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)異常增生是AS等血管疾病發(fā)生的重要致病因素〔5〕。目前，關(guān)于VEGF對(duì)VSMCs功能的影響及相關(guān)機(jī)制的研究未見報(bào)道。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了VEGF對(duì)VSMCs細(xì)胞株功能的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人VSMCs株由美國(guó)Robert Wood Johnson醫(yī)學(xué)院李少華教授惠贈(zèng)，為H1TB5克隆株。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開始實(shí)驗(yàn)。活化實(shí)驗(yàn)采用0、0.1、0.2、0.4 μg/ml的VEGF及0.4 μg/ml的VEGF處理臍靜脈血管內(nèi)皮(MRVEC)0、24、48、72 h。

1.2 細(xì)胞總蛋白提取 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞以冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，400 r/min離心5 min；棄上清，細(xì)胞沉淀中加入蛋白酶磷酸酶抑制劑和100 μl CytoBuster 蛋白提取試劑，高速渦旋細(xì)胞裂解混合物25 s，室溫放置15 min；4℃，12 000 r/min離心15 min；所得上清部分即細(xì)胞總蛋白，除留部分樣品檢測(cè)蛋白濃度外，其余分裝15 μl/管，-80℃凍存。

1.3 二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度 按說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品BSA；按體積比為50∶1混合BCA 試劑A和試劑B，即為工作液；96孔板中每孔加入200 μl/孔工作液，隨后加入25 μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，每種樣品設(shè)置3復(fù)孔。37℃孵育30 min；振蕩器短暫混勻后在波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值和濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品的OD 值推算各蛋白樣品濃度。

1.4 Western印跡 等量的提取蛋白經(jīng)8%～10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。第2天用0.1% TBST洗膜3次，5 min/次，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。Actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 噻唑藍(lán)(MTT)增殖檢測(cè) 上述SDF-1處理的細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速震蕩10 min后，波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值。阻斷絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK/Erk)信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)中，在加入完全培養(yǎng)基及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)前，先以U73122(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h。

1.6 凋亡率檢測(cè) 收集上述SDF-1處理的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，1% BSA PBS洗滌1次。用100 μl Binding緩沖液將細(xì)胞重懸，加入2 μl Annexin V染料和0.1 μl碘化丙啶(PI)染料，避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。阻斷磷酸肌醇3激酶(PI3K)和Erk1/2信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)中，在加入完全培養(yǎng)基及SDF-1前，先以U73122(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF對(duì)VSMCs細(xì)胞株增殖和凋亡能力的影響 隨著VEGF濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，VSMCs細(xì)胞株增殖能力逐漸升高(P<0.01)，凋亡水平則逐漸降低(P<0.01)。見圖1。

圖1 VEGF對(duì)VSMCs細(xì)胞株增殖和凋亡能力的影響

2.2 VEGF對(duì)VSMCs細(xì)胞株磷脂酶(PLC)-γ1信號(hào)通路活化的影響 隨著VEGF濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)(VEGF濃度為0.4 μg/ml)，VSMCs細(xì)胞株中PLC-γ1蛋白磷酸化水平逐漸升高。見圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)VEGF對(duì)VSMCs細(xì)胞株P(guān)LC-γ1和PI3K信號(hào)通路活化的影響

2.3 U73122阻斷VSMCs細(xì)胞株P(guān)LC-γ1信號(hào)通路效果檢測(cè) 以U73122(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h，可顯著阻斷VSMCs細(xì)胞株P(guān)LC-γ1信號(hào)通路。見圖3。

圖3 PLC-γ1信號(hào)通路阻斷效果檢測(cè)

2.4 PLC-γ1和PI3K信號(hào)通路在VEGF影響VSMCs細(xì)胞株增殖和凋亡中的作用 與VEGF處理組相比，阻斷VSMCs細(xì)胞株P(guān)LC-γ1信號(hào)通路后，VSMCs細(xì)胞株的增殖能力顯著降低(P<0.01)，而凋亡水平顯著升高(P<0.01)。見圖4。

圖4 PLC-γ1信號(hào)通路在VEGF促VSMCs細(xì)胞株增殖和凋亡中的作用

3 討 論

AS是動(dòng)脈壁上沉積了一層像小米粥樣的脂類，使動(dòng)脈彈性減低、管腔變窄的病變〔6～8〕。AS是冠心病和糖尿病共同的病理基礎(chǔ)〔2〕。同時(shí)，糖尿病患者伴有的脂質(zhì)清除能力下降等病變又會(huì)導(dǎo)致AS的發(fā)生和發(fā)展〔9〕。目前已知VSMCs異常增生是AS等血管疾病發(fā)生的重要致病因素〔5〕。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，二條分子量各為24 kD的單鏈以二硫鍵組成二聚體。VEGF在維持血管內(nèi)皮的完整性和功能調(diào)控方面具有重要的作用，此外，VEGF還參與新生血管生成的調(diào)控〔3〕。研究顯示，VEGF與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，VEGF可通過調(diào)控新生血管生成和炎癥因子表達(dá)而參與AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展和失穩(wěn)定性〔4〕。同時(shí)，康前雁等〔10〕的研究證實(shí)，糖尿病患者血清VEGF濃度與糖化血紅蛋白(HbA1c)和糖尿病病程具有顯著正相關(guān)性。這些結(jié)果提示，VEGF可能會(huì)通過影響VSMCs的增生而促進(jìn)AS的發(fā)生，也可能會(huì)成為糖尿病患者AS發(fā)生的影響因素。目前關(guān)于VEGF對(duì)VSMCs功能的影響及相關(guān)機(jī)制的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，VEGF可通過激活VSMCs細(xì)胞株中的PLC-γ1信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)VSMCs細(xì)胞株的增殖能力，并抑制VSMCs細(xì)胞株的凋亡水平，從而在糖尿病患者AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。

1 梁玉娥，王建平.SDF-1/CXCR4與糖尿病大血管病變關(guān)系的研究〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014；30(4)：528-30.

2 張子新，余陸嬌，張立敏，等.法舒地爾對(duì)糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響〔J〕.中國(guó)循環(huán)雜志，2013；28(5)：384-7.

3 段 薇，張學(xué)梅，于 萌，等.2型糖尿病大鼠急性心肌缺血對(duì)心肌新生血管的影響〔J〕.中華糖尿病雜志，2012；4(6)：361-4.

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5 李代欣，馬占龍，李 澄.動(dòng)脈粥樣硬化中的血管平滑肌細(xì)胞及其分子影像學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2012；18(16)：2539-42.

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10 康前雁，楊 玉，張秀麗，等.糖尿病患者血清VEGF濃度與糖化血紅蛋白及糖尿病病程相關(guān)性研究〔J〕.國(guó)際眼科雜志，2010；10(12)：2273-4.

〔2014-10-27修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2014211C129)；新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院院內(nèi)項(xiàng)目(No.WFY2013011)

王敏哲(1960-)，男，碩士，主任醫(yī)師，副教授，主要從事糖尿病及其發(fā)病機(jī)制研究。

高 靜(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病及其發(fā)病機(jī)制研究。

R54

A

1005-9202(2015)12-3257-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.031