高烏甲素對人非小細胞肺癌A549細胞株的作用及機制

鄭富霞

(河南省中醫(yī)院肺病科，河南 鄭州 450000)

高烏甲素對人非小細胞肺癌A549細胞株的作用及機制

鄭富霞

(河南省中醫(yī)院肺病科，河南 鄭州 450000)

目的 觀察高烏甲素(LA)對人非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞株的作用并探討其可能存在的分子機制。方法 采用由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心細胞庫提供的人NSCLC細胞株A549株。通過給予不同濃度的LA進行干預(yù)和MTT比色分析法、實時熒光定量PCR以及流式細胞儀等檢測方法，探討不同濃度的LA對NSCLCA549細胞株的生長抑制、凋亡率、細胞周期和Cyclin E1表達的影響。結(jié)果 LA對細胞的抑制作用規(guī)律呈劑量依賴性，相較于對照組，濃度在0.48～7.68 mg/ml的LA對于細胞的抑制作用均有著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；在相應(yīng)的各時間點，濃度為0.48和0.96 mg/ml的LA組A549細胞凋亡率均有著統(tǒng)計學(xué)的差異(P<0.05)；濃度為0.96 mg/ml的LA組細胞周期G0/G1期比例顯著上升，而S期比例下降(P<0.05)；濃度為0.48和0.96 mg/ml的LA組A549 細胞的Cyclin E1 mRNA相對表達量均明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 LA具有抗腫瘤的療效，其分子機制可能與腫瘤細胞的生長、凋亡、細胞周期以及Cyclin E1表達有關(guān)。

高烏甲素；非小細胞肺癌

非小細胞肺癌(NSCLC)占已診斷肺癌的85%左右，其中大部分患者在確診的時候病情已進入了晚期，無法通過手術(shù)而治愈。對于放、化療，晚期肺癌的敏感性欠佳，同時由于存在放化療毒性反應(yīng)，從而對其療效的提高進行了限制，故找尋低毒高效的天然藥物對治療NSCLC特別是晚期患者有著重要的價值〔1〕。本研究旨在通過對高烏甲素(LA)對人NSCLC A549細胞株作用的觀察，探討其可能存在的分子機制。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 采用由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心細胞庫提供的人NSCLC細胞株A549株。于RPMI-1640培養(yǎng)液(含鏈霉素和青霉素各10 U/ml，10%的胎牛血清)中進行常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)于5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，采用0.25%的胰蛋白酶對其進行消化傳代。主要試劑和藥品：中國科學(xué)院華南植物所制備的鹽酸LA；美國Sigma公司生產(chǎn)的RNA酶、碘化丙啶(PI)和二甲基亞砜(DMSO)、鏈霉素、青霉素和胰蛋白酶。美國Gibco公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)液。杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)的胎牛血清。南京凱基生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Annexin V-FIFC/PI試劑盒；Fermentas公司生產(chǎn)的Maxima? SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit；上海英駿生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PCR引物。實驗主要儀器：美國ABI公司生產(chǎn)的ABI Stepone Plus熒光實時定量PCR儀；美國Sigma公司生產(chǎn)的冷凍高速離心機；美國BD公司生產(chǎn)的BD FACSAAria流式細胞儀；日本Olympus株式會社生產(chǎn)的IX51倒置熒光顯微鏡；芬蘭TECAN GeNios公司生產(chǎn)的MK3型酶標儀；新加坡Esco公司生產(chǎn)的超凈工作臺；德國Memmert公司生產(chǎn)的電熱恒溫干燥器；波蘭Shel-Lab公司生產(chǎn)的CO2培養(yǎng)箱。

1.2 細胞增殖抑制率的測定 采用MTT比色分析法。選擇對數(shù)生長期A549細胞(細胞數(shù)1×103/孔)，注入96孔培養(yǎng)板內(nèi)過夜培養(yǎng)，第2天加入LA，最終的濃度分別是0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、3.84、7.68 mg/ml，在陰性對照組中只加PBS，一種濃度設(shè)置5個復(fù)孔。于5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行48 h的培養(yǎng)。將20 μl的MTT液注入每孔進行培養(yǎng)，4 h后去除上清液，以150 μl/孔加入DMSO液，使用酶標儀選取492 nm波長對各孔的光密度D(λ)進行測定，細胞增殖抑制率(%)=〔1- D(λ)實驗組/ D(λ)陰性對照〕×100%，對藥物所起的抑制作用進行觀察，計算IC50。

1.3 A549細胞凋亡率的檢測 采用Annexin V-FIFC/PI雙標法。選取對數(shù)生長期A549細胞，于6孔板內(nèi)接種，24 h培養(yǎng)后，將濃度分別為0.24、0.48、0.96 mg/ml的LA加入其中培養(yǎng)，24、36、48 h后，在離心管內(nèi)轉(zhuǎn)入5×105細胞，提取50 μl與緩沖液結(jié)合，重懸細胞，將Annexin V-FIFC及PI分別注入其中，避光室溫下10 min上樣，即可用流式細胞儀測定細胞凋亡。重復(fù)3次該實驗。

1.4 A549細胞周期的檢測 選擇對數(shù)生長期A549細胞，于6孔板內(nèi)接種，24 h培養(yǎng)后，將濃度分別為0.24、0.48、0.96 mg/ml的LA加入其中培養(yǎng)。48 h后用PBS液洗滌，將細胞收集，在4℃ 75%的酒精溶液內(nèi)封口，于-20℃下固定12 h。離心、洗滌，在RNase的溶液內(nèi)重懸，避光條件下靜置半小時，將PI溶液加入其中，避光孵育半小時，用300目篩網(wǎng)濾過后，用流式細胞儀對細胞周期進行檢測，一次分析細胞10 000個，Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)，用各期細胞所占比值形式表示。重復(fù)3次該實驗。

1.5 CyclinE1基因表達的檢測 實時熒光定量PCR。選擇對數(shù)生長期A549細胞，于6孔板內(nèi)接種，24 h培養(yǎng)后，將濃度分別為0.24、0.48、0.96 mg/ml的LA加入其中培養(yǎng)。48 h后，去除上清液，Trizol法對各組細胞的總RNA進行提取，各自取1 μg進行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA作模板，對Cyclin E1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平實施實時熒光定量PCR法進行檢測，內(nèi)參照物為β-actin。引物序列：β-actin，擴增產(chǎn)物152 bp，上游：5'- TGACCGGTATATGGCGACAC-3'，下游：5'- CTCCTGAACAAGCTCCATCTG-3'；擴增產(chǎn)物109 bp，上游：5'- ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT，下游：5'- CTTGCACATGCCGGAGCCGTT-3'；Invitrogen公司合成。擴增條件：95℃10 min；95℃15 s、60℃30 s、72 ℃15 s，總共循環(huán)40個。數(shù)據(jù)用比較CT法分析，目的基因相對表達量用2-△△CT表示，將對照組目的基因mRNA均數(shù)表示為1，對各處理組的CyclinE1 mRNA相對表達量進行計算。該實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 LA對A549細胞生長的抑制作用 LA對細胞的抑制作用規(guī)律呈劑量依賴性，相較于對照組〔(0.1±0.8)%〕，濃度在0.48、0.96、1.92、3.84、7.68 mg/ml的LA對于細胞的抑制作用〔(13.2±4.4)%、(22.4±5.7)%、(41.3±6.8)%、(59.2±8.4)%、(82.2±9.1)%〕均有著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。0.06、0.12、0.24 mg/ml LA對細胞抑制率〔(1.5±0.8)%、(3.0±1.3)%、(7.1±3.3)%〕與對照組無明顯差異。將LA濃度與其對細胞的抑制率行直線回歸分析，方程為:Y = 6.94+10.895X，計算得48 h 高烏甲素的IC50為3.952 mg/ml。

2.2 LA對A549細胞凋亡的作用 相較于對照組，在相應(yīng)的各時間點，濃度為0.48和0.96 mg/ml的LA組A549細胞凋亡率均有著統(tǒng)計學(xué)的差異(P<0.05)。見表1。

2.3 LA對A549細胞周期的影響 相對于對照組，濃度為0.96 mg/ml的LA組的細胞周期G0/G1期比例顯著上升，而S期比例下降(P<0.05)。見表2。

2.4 LA對Cyclin E1的表達影響 0.48和0.96 mg/ml LA組A549 細胞Cyclin E1 mRNA相對表達量(0.802±0.161、0.774±0.147)均明顯低于對照組(1±0)(P<0.05)。0.24 mg/ml LA組表達量(0.921±0.214)與對照組差異不明顯。

表1 LA對A549細胞凋亡率的影響

與對照組相比較：1)P<0.05，下表同

表2 LA對A549細胞周期的影響

3 討 論

腫瘤干細胞、腫瘤多藥耐藥機制以及化療帶來的毒副作用都限制了肺癌治療期間化療的應(yīng)用。針對晚期肺癌患者，中醫(yī)藥有著其獨特的優(yōu)點，可以延長生存期、改善患者的生活質(zhì)量、緩解癥狀以及提高患者自身的機體免疫力〔2〕。對于放、化療，中醫(yī)藥有著逆轉(zhuǎn)化療耐藥、誘導(dǎo)凋亡和分化等的減毒和增效的作用。通常晚期肺癌患者由于癌痛的折磨而嚴重影響了其自身的生存質(zhì)量，故化療藥經(jīng)常用鎮(zhèn)痛藥來止痛。中醫(yī)學(xué)上認為，腫瘤疼痛的根本原因是經(jīng)絡(luò)氣血失調(diào)，表現(xiàn)為氣滯血瘀、痰濕阻滯以及經(jīng)絡(luò)閉阻等。趨勢化痰、通絡(luò)以及活血化瘀等是其主要的治療方法，臨床上長期應(yīng)用可以獲取較好的療效。LA作為非成癮性的鎮(zhèn)痛藥，屬于中藥單體，有著較好的鎮(zhèn)痛效果。前期的實驗〔3〕結(jié)果顯示，LA與鉑類藥物結(jié)合使用有著增敏的作用。最近的研究結(jié)果顯示，LA有著潛在的抗腫瘤的作用。對人急性白血病細胞株HL-60，LA注射液有著潛在誘導(dǎo)凋亡和分化的作用〔4〕。

本實驗說明LA存在抗腫瘤的作用。最近的研究〔5〕顯示，天然產(chǎn)物能通過細胞周期阻滯或誘導(dǎo)凋亡對腫瘤的生長進行抑制。CyclinE調(diào)控細胞從G1期進入至S期限制點R，如果通過此限制點，細胞則無法逆轉(zhuǎn)，只能進入細胞周期，其作為G1/ G0期的一個重要調(diào)節(jié)者，于大量的腫瘤細胞內(nèi)呈高表達的狀態(tài)。細胞周期從G0期進入G1期，需要積累一定量的CyclinE1。Rb磷酸化以及G0期至G1期的轉(zhuǎn)換末期能使CyclinE1活化。其表達與大量腫瘤預(yù)后、進展、侵襲、轉(zhuǎn)移、形成均密切相關(guān)。大量的化療藥可以通過激活細胞周期的檢測點，達到抑制損傷修復(fù)和腫瘤周期阻滯的目的，從而對腫瘤的分裂、增殖進行抑制。對CyclinE1表達的抑制，可以起到控制細胞周期的增殖期間的細胞數(shù)(乃至腫瘤增殖)的重要作用〔6〕。本實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LA可以抑制A549的細胞生長，致使G1/ G0期阻滯以及腫瘤細胞凋亡。LA存在下調(diào)CyclinE1表達的可能，但尚需深入研究其具體的體內(nèi)外分子作用機制〔7〕。

1 Yang HJ,Youn H,Seong KM,etal.Phosphorylation of ribosomal protein S3 and antiapoptotic TRAF2 protein mediates radioresistance in non-small cell lung cancer cells〔J〕.J Biol Chem,2013;288(5):2965-75.

2 Li Y,Chao Y,Fang Y,etal.MTA1 promotes the invasion and migration of non-small cell lung cancer cells by downregulating miR-125b〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2013;32(1):33-40.

3 Zhou M,Li Y,Liu C,etal.Simultaneous determination of lappaconitine hydrobromide and isopropiram fumarate in rabbit plasma by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection〔J〕.Electrophoresis,2012；33(16):2577-83.

4 Tan C,Qian X,Jia R,etal.Matrine induction of reactive oxygen species activates p38 leading to caspase-dependent cell apoptosis in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2013;30(5):2529-35.

5 Yoon HJ,Cho YR,Joo JH,etal.Knockdown of integrin alpha3 beta1 expression induces proliferation and migration of non-small cell lung cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2013;29(2):662-8.

6 Miao L,Zhu S,Wang Y,etal.Discoidin domain receptor 1 is associated with poor prognosis of non-small cell lung cancer and promotes cell invasion via epithelial-to-mesenchymal transition〔J〕.Med Oncol,2013;30(3):626-35.

7 Ju L,Zhou C.Association of integrin beta1 and c-MET in mediating EGFR TKI gefitinib resistance in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Cell Int,2013;13(1):15-23.

〔2013-12-15修回〕

(編輯 苑云杰)

2008年度河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目(200803048)；2007年度河南省衛(wèi)生廳普通攻關(guān)項目(200703021)

鄭富霞(1974-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疑難疾病研究。

R734

A

1005-9202(2015)12-3231-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.019