K-CoxB-JN復(fù)方提取物對CVB3感染小鼠心肌損傷的保護作用

林 清 馬會霞 高秀娟 謝 飛 徐 靜 王 巍 包巨太

(河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

K-CoxB-JN復(fù)方提取物對CVB3感染小鼠心肌損傷的保護作用

林 清 馬會霞 高秀娟 謝 飛 徐 靜 王 巍 包巨太

(河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

目的 探討抗柯薩奇病毒B病毒性心肌炎膠囊(K-CoxB-JN)復(fù)方提取物總黃酮和總皂苷對于CVB3病毒感染小鼠心肌損傷模型的保護作用。方法 將復(fù)方提取物分為不同組別，觀察其對小鼠心脾指數(shù)、小鼠血清肌酸激酶(CK)；乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影響。結(jié)果 K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮低、中、高三組、黃酮+皂苷中劑量組及水提物組對于心肌酶CK、CK-MB及cTnI的活性具有明顯抑制作用，K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮中、高三組及黃酮+皂苷組升高SOD活性，K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮中劑量組、黃酮+皂苷中劑量組及水提物組降低MDA的含量。結(jié)論 K-CoxB-JN復(fù)方提取物對心肌損傷小鼠血清CK、LDH 、CK-MB、cTnI有抑制作用，對SOD 和MDA均有改善作用，K-CoxB-JN復(fù)方提取物對心肌具有保護作用。

K-CoxB-JN復(fù)方提取物；病毒性心肌炎；心肌酶；超氧化物歧化酶；丙二醛

病毒性心肌炎(VMC)是一種心肌纖維及心肌細胞受到病毒侵害后而出現(xiàn)的一系列變性、壞死的疾病。VMC的發(fā)病機制尚不清楚。中醫(yī)藥治療VMC是目前研究的熱點，并取得了一定的成績。抗柯薩奇病毒B病毒性心肌炎膠囊(K-CoxB-JN)是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下研制而成的中藥復(fù)方制劑，對于VMC的治療具有較好的療效〔1，2〕。本實驗擬探討K-CoxB-JN復(fù)方提取物對小鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級Balb/c雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，北京華埠康生物科技股份有限公司，動物合格證號SCXK(京)2009-0004，實驗過程中對動物處置符合國家科技部2006年9月頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑 K-CoxB-JN復(fù)方藥材(西洋參、黃芪、丹皮、麥冬、五味子、萊菔子、王不留行)購自石家莊市柏林藥材加工廠(批號20100225)；CVB3病毒由中國中醫(yī)科學(xué)院提供，試驗用病毒稀釋度為5×10-7；血清肌酸激酶(CK)測定試劑盒(批號：20100111)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定試劑盒(批號：20100111)、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(批號：20100111)，均購自南京建成生物工程研究所；心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測定試劑盒，購自德國Bgaer公司；K-CoxB-JN復(fù)方提取物總黃酮、總皂苷由課題組自制。

K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮及總皂苷提取方法：采用乙醇回流提取法，首先稱取藥材，置圓底燒瓶中，分別一次加入8倍量和6倍量濃度為80%乙醇，然后加熱回流提取3 次，每次2 h，將最終3次提取的藥液合并，過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇同時濃縮藥液。(1)最后濃縮液分別用石油醚及乙酸乙酯等體積萃取3次，取上清液，合并濃縮提取液，剩余藥液70℃水浴蒸發(fā)成膏狀，之后在70℃鼓風(fēng)干燥機中干燥即得復(fù)方總黃酮。(2)濃縮液分別用石油醚及正丁醇等體積萃取3次，取上清液，合并提取液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收正丁醇，剩余藥液70℃水浴蒸發(fā)成膏狀，在65℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，即得復(fù)方總皂苷。

K-CoxB-JN復(fù)方水提物制備方法：首先稱取藥材，分別加入8、6倍量水煎煮2次，每次2 h，合并提取液，趁熱過濾，濾液濃縮、干燥至恒重即得水提物。

1.1.3 實驗儀器 電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；電子調(diào)溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司，型號：98-1-B；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-5205；全自動生化分析儀，北京朗普信科技有限公司；低溫離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠，型號TDL-5-A；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：GZX-9070 MBE；Bio-Rad3550型自動酶聯(lián)免疫測定儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠105只，隨機分為正常對照組、模型組、K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮低劑量組(HL)、K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮中劑量組(HM)、K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮高劑量組(HH)，K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮及總皂苷組(H+Z)、K-CoxB-JN復(fù)方水提物組(W)，每組15只。每組小鼠腹腔無菌注射濃度為5×10-6.2的CVB3病毒，每次0.2 ml/只，建立小鼠心肌損傷模型；正常對照組腹腔注射等體積不含有CVB3病毒的Hep-2細胞凍融液。接種病毒后0.5 h采用灌胃法給藥：HL組為0.2 g/kg、HM組為0.4 g/kg、HH組為0.8 g/kg、H+Z組為0.4 g/kg、W組為0.4 g/kg、正常對照組和模型組灌胃生理鹽水，各組1次/d，連續(xù)14 d。根據(jù)癥狀及血清心肌酶活力輔以心電圖檢查確定模型是否成功。

1.2.2 心脾指數(shù)測定 小鼠心臟、脾臟稱重，脾指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)；心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.2.3 血清心肌酶及cTnI測定 建立模型，在給藥第15天摘取小鼠眼球取血，用酶標(biāo)儀測定CK、LDH和CK-MB吸光度值，按試劑盒說明書操作。按試劑盒說明分別測定心肌組織丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較在方差齊性時用LSD，方差不齊時選用Tamhane法。

2 結(jié) 果

2.1 心脾指數(shù)測定結(jié)果 HM、HH、H+Z組心臟指數(shù)與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，HM組及H+Z組的小鼠脾臟指數(shù)與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 K-CoxB-JN復(fù)方提取物對小鼠心臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2 血清心肌酶及cTnI測定結(jié)果 HM、HH、HZ組及H+Z組均能降低CK和cTnI水平，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，HL組及H+Z組降低CK-MB水平，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HM組及H+Z組降低LDH水平，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3 心肌組織MDA含量及SOD活性測定結(jié)果 K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮中、高劑量及黃酮+總皂苷均能升高SOD的活性，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮中劑量組及復(fù)方總黃酮+總皂苷組能降低MDA含量，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 K-CoxB-JN復(fù)方提取物對小鼠血清CK、LDH 、CK-MB、cTnI的影響

表3 K-CoxB-JN復(fù)方提取物對小鼠心肌組織SOD，MDA 的影響

3 討 論

VMC的發(fā)病機制目前還沒有闡明，主要與病毒作用機體引起細胞凋亡及免疫反應(yīng)有關(guān)。①病毒直接作用機體，侵襲機體心肌細胞導(dǎo)致VMC的發(fā)生。VMC的發(fā)生與多種病毒有關(guān)，但柯薩奇B組病毒(CoxB)最常見〔3〕。CoxB侵襲機體后，與心肌細胞接觸并與其細胞膜表面的相應(yīng)受體結(jié)合，將病毒RNA注入到心肌細胞質(zhì)中，并感染使之凋亡。②細胞凋亡，主要是通過穿孔素(PFP)和顆粒酶產(chǎn)生的細胞毒作用，還與心肌細胞膜上的Fas有關(guān)，對心肌細胞進行殺傷，使其凋亡。③免疫系統(tǒng)失衡。VMC時，患者體內(nèi)可檢測到約20種細胞因子和多種激素水平發(fā)生變化，其中較重要的有白介素、干擾素-γ、腫瘤壞死因子等。這些細胞因子、相互聯(lián)系、協(xié)同作用，促使炎癥反應(yīng)發(fā)生。④生化機制。VMC的發(fā)病機制與心肌組織中產(chǎn)生大量的自由基有一定關(guān)系。當(dāng)病毒侵襲機體，心肌細胞產(chǎn)生大量自由基，這些自由基對心肌細胞具有損傷作用。

對于VMC的命名，中醫(yī)文獻中并沒有確切的記載，在《國標(biāo)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語疾病部分》記載的“心癉”一病，從病因和臨床表現(xiàn)與本病相似，也有一些學(xué)者認(rèn)為本病可以歸屬“心悸”、“胸痹”等病的范疇。K-CoxB-JN由西洋參、麥冬、丹皮、五味子、黃芪等中藥組成，西洋參莖葉皂苷對于心臟具有保護作用，馬寶蘭等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)西洋參莖葉總皂苷可降低CK的活性，西洋參二醇組皂苷(PDQS)注射液靜脈滴注對病人缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用，而且PDQS能加強SOD的活性。黃芪具有抗病毒、改善微循環(huán)、促進心肌供氧、降低心肌耗氧量、調(diào)節(jié)免疫等作用〔5〕，對心血管具有一定的保護作用。周曉春等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)生黃合劑能明顯提高VMC小鼠血清SOD活性、降低MDA含量，對CVB3感染鼠也有一定治療作用。

本實驗結(jié)果說明K-CoxB-JN總黃酮及總皂苷可以降低心肌酶水平，對心肌具有保護作用。本實驗主要檢測心肌酶中的CK、 LDH和CK-MB。CK是人體能量代謝過程中重要的酶類，存在于動物的心臟、腦以及肌肉等組織。VMC時，CK比其他酶出現(xiàn)早并迅速升至高峰，是應(yīng)用最廣泛的心肌損傷指標(biāo)。CK 3個同工酶中的CK-MB多存在于心肌，反映心肌損傷的情況，對心肌損害的早期診斷具有重要價值。LDH存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，其中在腎臟含量較高，是一種糖酵解酶。在心肌中cTnI的含量是CK-MB的13倍，檢測外周血cTnI含量可反映心肌細胞的損傷程度〔7〕。由于cTnI變化在VMC中具有較高的特異性和靈敏性，目前已經(jīng)確定cTnI對VMC心肌損傷的診斷價值。MDA能夠直接反映體內(nèi)自由基損害的指標(biāo)，是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物。當(dāng)心肌細胞被病毒侵襲后，心肌細胞膜會引發(fā)一系列的氧化反應(yīng)，使細胞膜破壞，導(dǎo)致心肌組織氧自由基和脂質(zhì)過氧化損傷。SOD是可以清除自由基的一種酶，過多的自由基可使SOD損耗增加。降低MDA的含量和提高SOD的活性，清除氧自由基，可加速VMC的康復(fù)。

上述實驗結(jié)果表明K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮+總皂苷對VMC小鼠有很好的治療作用，并且優(yōu)于水提物組，為進一步提取復(fù)方中的有效成分打下基礎(chǔ)。

1 邢紀(jì)萍，包巨太，李志田，等.抗柯薩奇B 中藥膠囊治療病毒性心肌炎的臨床療效評價〔J〕.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2003;8(6)：701-3.

2 呂立勛，吳范武，李 潔，等.抗毒補心膠囊治療病毒性心肌炎療效觀察〔J〕.山東醫(yī)藥，2010;50(5)：36-7.

3 Kashimura T，Kodama M，Hotta Y，etal.Spatiotemporal changes of coxsackievirus and adenovirus receptor in rat hearts during postnatal development and in cultured cardiomyocytes of neonatal rat〔J〕.Virchows Arch，2003;444(3)：283-92.

4 馬寶蘭，秦緒花，史載祥，等.西洋參臨床藥理研究進展(2004-2010)〔J〕.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011;23(5)：88-92.

5 于永慧，汪 翼.黃芪治療病毒性心肌炎的研究進展〔J〕.實用兒科臨床雜志，2005;20(8)：807-8.

6 周曉春，顏 勇，王寶忠，等.生黃合劑對病毒性心肌炎小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響〔J〕.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008;25(1)：10-2.

7 余新超，鄭芙林，汪思應(yīng),等.急性病毒性心肌炎血清肌鈣蛋白I的表達及臨床意義〔J〕.中國基層醫(yī)藥雜志，2002;9(12)：1067-8.

〔2014-10-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

The protection for myocardial injury in mice by CVB3 of K-CoxB-JN compound extract

LIN Qing,MA Hui-Xia,GAO Xiu-Juan,etal.

TCM College of Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei,China

Objective To discuss the myocardial protection about viral myocarditis mice induced by CVB3 about compound extracting flavonoids and saponins from Againsting coxsackie virus B viral myocarditis capsule(K-CoxB-JN).Methods The influences from indexes of the hearts and spleens,CK,LDH,CK-MB,cTnI,SOD and MDA through different groups from compound extracting were observed.Results The group of compound flavonoids and the group of(flavonoids+ saponins)controled the activities about CK,LDH,CK-MB and cTnI，and improved the the contents of SOD and MDA.Conclusions K-CoxB-JN compound extracting could control the activities about CK,LDH,CK-MB,cTnI,SOD and MDA from the mice injuryed myocardial,and K-CoxB-JN compound flavonoids and saponins could protect the myocardial cells.

K-CoxB-JN compound extracting；Viral myocarditis；Myocardial enzyme；SOD；MDA

國家“十一五”規(guī)劃科技重大專項課題(2009ZX09103-442)

包巨太(1957-)，男，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事K-CoxB-JN活性成分的提取及其優(yōu)化研究。

林 清(1983-)，女，講師，碩士，主要從事中醫(yī)基本理論與臨床應(yīng)用研究。

R246.1

A

1005-9202(2015)12-3199-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.006