基于PCR array技術(shù)探討高脂血癥大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)

朱美林，賈連群，陳 陽，曹 媛，李 寧，李 靜

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110032)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

基于PCR array技術(shù)探討高脂血癥大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)

朱美林，賈連群，陳 陽，曹 媛，李 寧，李 靜

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110032)

目的 利用PCR array技術(shù)檢測高脂血癥大鼠肝臟動脈粥樣硬化(AS)信號通路相關(guān)基因mRNA水平，初步揭示上述基因表達(dá)變化與高脂血癥發(fā)生的關(guān)系。方法 SPF級健康雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為空白對照組和高脂血癥組，高脂血癥組給予高脂飼料喂飼造模。全自動生化分析儀檢測血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，HE染色觀察肝臟形態(tài)變化，油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積，提取各組大鼠肝臟總RNA，應(yīng)用AS信號通路PCR芯片檢測高脂血癥大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組相比，高脂血癥組大鼠血清HDL-C水平顯著降低，TC和LDL-C水平顯著升高，肝細(xì)胞形成大量脂質(zhì)沉積。PCR array 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，高脂血癥組大鼠上調(diào)≥2倍的基因49個(gè)，占55%，如Serpinb2 (PAI-2)、Il2、Fga、Il5、Il4、Tnf、Cd44、Bid、Vwf、Mmp3、Icam1、Apob等基因；下調(diào)≥2倍的基因20個(gè)，占22%，如 Tgfb1、Vegfa、Lpl、Sod1、Fas、Pparg等基因，涉及應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、凝血、粘附分子、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、細(xì)胞生長和增殖以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面。結(jié)論 肝臟 AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化可能與高脂血癥發(fā)生有關(guān)。

膽固醇；高脂血癥；PCR array；肝臟；信號通路

高脂血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的重要病理基礎(chǔ)，大量的基礎(chǔ)研究資料和臨床實(shí)踐證明: 高脂血癥與AS的形成及冠心病(CHD)的發(fā)生發(fā)展關(guān)系極為密切[1-2]。有研究表明，AS 的危險(xiǎn)因素累積得越多，其致 AS作用越強(qiáng)，發(fā)生心腦血管事件的概率越大[3]。不僅如此，有資料還顯示， 心血管疾病已成為我國城鄉(xiāng)的第一位死亡原因[4]。隨著生活水平的逐步提高，目前高脂血癥的發(fā)生率呈上升趨勢[5]，從分子水平揭示高脂血癥發(fā)生機(jī)理，為臨床防治高脂血癥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)顯得尤為重要[6]。本研究利用PCR array技術(shù)檢測高脂血癥大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA水平，初步揭示上述基因表達(dá)變化與高脂血癥發(fā)生的關(guān)系。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠，SPF級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，雄性，體重(300±10)g，合格證號SCXK(京)2012-0001。動物購進(jìn)后，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25 ± 1)℃，自然光照，喂以正常飼料自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)過程。

1.2 試劑與儀器 HE染色液購自北京鼎國生物技術(shù)公司；TG、TC、HDL-C、LDL-C、測定試劑盒(批號：0113011)，均購自四川邁新生物技術(shù)有限公司；油紅O購自美國Sigma公司；Qiagen RNeasy Plus Mini kit；Qiagen RT2 First Strand kit；Qiagen RT2 SYBR Green ROX qPCRkit；Qiagen Atherosclerosis PCR Array；熒光顯微鏡(德國 Leica)；7500 Real Time PCR儀(Applied Biosystems，美國)；Veriti 96 well Thermal Cycler(Applied Biosystems，美國)；全自動生化分析儀(日本東芝)。

2 方法

2.1 分組、造模及標(biāo)本采集 30只SD大鼠，隨機(jī)分為空白對照組、高脂血癥組?？瞻讓φ战M予正常飼料喂養(yǎng)，高脂血癥組予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方：6 %蔗糖、1 %谷氨酸鈉、5 %蛋黃粉、8 %花生油、1.5 %膽固醇、0.4 %甲基硫氧嘧啶，78.1 %基礎(chǔ)飼料。造模30 d，同時(shí)用高脂血癥模型評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，稱體重，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血5～10 mL，靜置1～2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，取上清液，低溫(4 ℃)保存。取大鼠肝組織，切成小塊，分別4%多聚甲醛固定及冷凍。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 血脂檢測 全自動生化分析儀測定血清中TG、TC、HDL -C、LDL -C 含量。

2.2.2 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 肝臟4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規(guī)方法進(jìn)行 70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(切片厚度5 μm) 、貼片、烤片后，用二甲苯脫蠟、70%～100%梯度酒精復(fù)水、蘇木精染色、70% 鹽酸酒精分色、伊紅復(fù)染后，再用 70%～100% 梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟形態(tài)。

2.2.3 油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積 肝臟樣本制備冰凍切片( 6 μm) ，切片干燥后入50%乙醇水洗，油紅O染色8 min，50%乙醇分化，自來水終止分化，蘇木素復(fù)染，自來水反藍(lán)，甘油明膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況。

2.2.4 PCR芯片檢測高脂血癥 大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá) 100 mg 組織液氮研磨后加入1 mL Trizol 裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入 0.2 mL氯仿，離心，吸取上層水相，加等量的異丙醇沉淀RNA，離心，緩慢加入75%乙醇洗滌，離心，空氣風(fēng)干后加入無RNA酶水溶解。紫外分光光度計(jì)測定260 nm 及280 nmOD值，計(jì)算 RNA 的濃度和純度。取0.5 μg RNA 用于RT-PCR，按照PCR芯片試劑盒說明操作。

3 結(jié)果

3.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血脂變化比較 與空白對照組比較，高脂血癥組大鼠血清TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.01)，HDL-水平顯著降低(P<0.01，見表1)。

組別空白對照組高脂血癥組TG(mmol/L)0．87±0．150．70±0．05TC(mmol/L)1．55±0．111．86±0．22??HDL-C(mmol/L)0．52±0．120．33±0．08??LDL-C(mmol/L)0．65±0．461．43±0．13??

與空白對照組比較，**P<0.01。

3.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)及油紅O染色改變 HE染色顯示空白對照組大鼠肝細(xì)胞索排列正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞無脂肪變性等異常改變，小葉內(nèi)無炎細(xì)胞浸潤。高脂血癥組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯，脂肪變性肝細(xì)胞體積增大，胞漿疏松，胞漿內(nèi)含脂肪滴空泡，部分肝竇間隙變窄，可見炎細(xì)胞浸潤。油紅O染色高脂血癥組大鼠脂肪變性肝細(xì)胞胞漿內(nèi)見染為紅色的脂肪滴(見圖1)。

3.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá) 芯片上包含84個(gè)與AS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，與空白對照組相比，高脂血癥組大鼠上調(diào)≥2倍的基因49個(gè)，占55%，如 Serpinb2 (PAI-2)、Il2、Fga、Il5、Il4、Tnf、Cd44、Bid、Vwf、Mmp3、Icam1、Apob等基因；下調(diào)≥2倍的基因20個(gè)，占22%，如 Tgfb1、Vegfa、Lpl、Sod1、Fas、Pparg(見表2)。

A、C：空白對照組; B、D：模型組; A、B： ( HE染色×200) ;C、D：(油紅O染色×400)。

表2 高脂血癥組上調(diào)或下調(diào)2倍的基因及數(shù)值變化

GenesymbolGeneMeanfoldchange高脂血癥組/空白對照組第1組：應(yīng)激反應(yīng)Il4Interleukin420．44↑TnfTumornecrosisfactor(TNFsuperfamily，member2)8．22↑Il2Interleukin225．23↑Tgfb1Transforminggrowthfactor，beta12．03↓Sod1Superoxidedismutase1，soluble8．02↓第2組：細(xì)胞凋亡BidBH3interactingdomaindeathagonist8．10↑VegfaVascularendothelialgrowthfactorA6．11↓Fas(Tnfrsf6)Fas(TNFreceptorsuperfamily，member6)8．22↓第3組：血液凝固和循環(huán)Serpinb2(PAI-2)Serpinpeptidaseinhibitor，cladeB(ovalbumin)，member226．96↑VwfVonWillebrandfactor7．69↑第4組：粘附分子Icam1Intercellularadhesionmolecule14．26↑Cd44Cd44molecule8．09↑第5組：細(xì)胞外分子Mmp3Matrixmetallopeptidase36．34↑Fga，F(xiàn)ibrinogenalphachain23．28↑Il5Interleukin520．95↑Lp1Lipoproteinlipase7．45↓第6組：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和運(yùn)輸ApobApolipoproteinB12．96↑第7組：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)PpargInterferongamma12．91↓

基因表達(dá)用PCR arry實(shí)驗(yàn)方法評估，上調(diào)：↑；下調(diào)↓。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血脂代謝異常是AS、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，脂類沉積和細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集在AS形成過程中始終為主要因素[7]。大量研究表明，高脂血癥可引起肝臟病變以及血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致單核細(xì)胞發(fā)生泡沫化，促進(jìn)AS的發(fā)生[8]。醫(yī)學(xué)研究表明血液中 的TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平異常是AS發(fā)生、發(fā)展的始動因素，心腦血管病的發(fā)病率與血清 TC及 LDL-C的濃度呈顯著正相關(guān)[9-10]，HDL-C濃度與AS呈負(fù)相關(guān)[11]。提示其可能通過調(diào)節(jié) TC、TG、LDL-C、HDL-C 等脂質(zhì)代謝紊亂達(dá)到治療AS的目的。

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，高蛋白、高脂飲食增多，運(yùn)動量減少，使得高血脂和動脈粥樣硬化的發(fā)病率逐年增長，并且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，用添加有膽固醇、蛋黃粉、豬油等成分的高脂飼料喂養(yǎng)大鼠 4 周時(shí)，血清 TC、TG 和 LDL-C 水平就有明顯升高[13]。本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，用高脂飼料喂養(yǎng)8周建立實(shí)驗(yàn)性高脂血癥動物模型。結(jié)果表明高脂飲食8周后出現(xiàn)穩(wěn)定的血漿高脂水平，TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，與基礎(chǔ)飲食大鼠血脂水平比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且，肝臟脂質(zhì)沉積與血清 TC、LDL-C 水平一致。這提示高脂血癥不僅能夠促進(jìn)血漿脂代謝紊亂，而且可以導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，最終會導(dǎo)致AS的發(fā)生。結(jié)果證明，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒Α?/p>

基因芯片(gene chip)技術(shù)，又稱DNA微陣列(microarray)，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其基本原理是通過雜交檢測信息[14]?；蛐酒夹g(shù)是隨著基因組計(jì)劃發(fā)展起來的生物技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，它具有快速、高通量、高準(zhǔn)確性、低成本等特點(diǎn)，且其操作簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化，適于推廣，顯示出廣闊的臨床應(yīng)用前景[15]。本研究選用的Qiagen Atherosclerosis PCR Array芯片包含了信號通路的84個(gè)關(guān)鍵基因。

AS信號通路是一條與應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、凝血、粘附分子、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、細(xì)胞生長和增殖以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面的信號通路，因此，本研究主要應(yīng)用PCR芯片檢測高脂血癥大鼠肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)。對肝臟AS信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化與高脂血癥及AS發(fā)生機(jī)制進(jìn)行初步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)， 與空白對照組相比，高脂血癥組上調(diào)≥2倍的基因49個(gè)，占55%。其中應(yīng)激反應(yīng)基因11個(gè)、細(xì)胞凋亡基因4個(gè)、血液凝固和循環(huán)基因3個(gè)、粘附分子基因10個(gè)、細(xì)胞外分子基因17個(gè)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因3個(gè)、細(xì)胞生長和增殖基因3個(gè)，如Serpinb2 (PAI-2)、Il2、Fga、Il5、Il4、Tnf、Cd44、Bid、Vwf、Mmp3、Icam1、Apob等基因；下調(diào)≥2倍的基因20個(gè)，占22%，其中細(xì)胞凋亡基因2個(gè)，粘附分子基因1個(gè)、細(xì)胞外分子基因3個(gè)、細(xì)胞生長和增殖基因2個(gè)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因1個(gè)，如 Tgfb1、Vegfa、Lpl、Sod1、Fas、Pparg。研究表明這些相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)/下調(diào)，可以引起相應(yīng)的效應(yīng)分子的變化，從而引起高脂血癥以及AS的發(fā)生。

我們的檢測結(jié)果雖然能在一定程度上提供較多的關(guān)于高脂血癥影響肝臟AS信號通路中相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化的信息，但是這些信息之間的相互關(guān)系以及各基因表達(dá)改變的實(shí)際意義尚不能給出明確解釋，而且基因表達(dá)的變化還受到多種復(fù)雜因素的影響，這些問題尚需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證和探討。

[1] 孟根杜希，徐風(fēng)芹. 蒙藥達(dá)日布八味丸治療高脂血癥46例療效觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012,27(3)：761-763.

[2] 楊舟，郁保生，呂瑤，等.四逆湯對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔血脂及高低密度脂蛋白含量的影響[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2012，26(7)：1-6.

[3] 劉艷群，謝鵬，朱冬梅.高血壓和高脂血癥致頸動脈粥樣硬化的臨床研究[J].職業(yè)與健康， 2013，29(12)：1433-1436.

[4] 易文，周瓊，黎玉冰，等.他汀類聯(lián)合非諾貝特治療混合型高脂血癥和致動脈粥樣硬化血脂異?；颊叩纳鐓^(qū)應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(18)：86-90.

[5] 謝霞，梁圣彬，李世存，等. 脂肪肝超聲診斷與血脂、血糖和肥胖的相關(guān)性分析[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(4)：331-333.

[6] Iversen A,Jensen J S,Scharling H,et al. Hypercholesterolaemiaand risk of coronary heart disease in the elderly:impact of age: The copenhagen city heart study[J]. Eur J Intern Med,2009,20(2):139-144.

[7] 王俊巖，朱美林，冷雪，等.丹參酮ⅡA對ApoE 基因敲除小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響及機(jī)制[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37(1)：94-98.

[8] 張娜，李林森，李志勇，彝藥塔若散干預(yù)高脂血癥金黃地鼠早期動脈粥樣硬化的藥效學(xué)研究[J].中草藥，2013，44(23)：3359-3363.

[9] McNeill K L,Fontana L,Russell-Jones D L,et al. Inhibitory effects of low-density lipoproteins from men with typeⅡdiabetes on endotheli-um-dependent relaxation [J]. J Am Coll Cardiol,2000,35(6):1622-1627.

[10] Nyg rdas P T,Gr nberg S A,Heikkil J, et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with a neurotropic alphavirus vector expressing tissue inhibitor of metalloproteinase-2[J].Scand J Immunol,2004,60(4) : 372-381.

[11] Pérez-Méndez O.Hight density lipoprotein (HDL).A therapeuticobiective in the atherosclerosis prevention?[J]. Arch Cardiol Mex,2004,74(1):53.

[12] Maya S,Camelia S,Gabriela C,et al.Endothelial cell response to Heperlipemia.Activation-dysfunction-injury,the protective role of simvastation[J]. Vascul Pharmacol,2002,38(5) : 275.

[13] 張海燕，鄔偉魁，賀婭，等.中藥對血管平滑肌細(xì)胞的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，21(17)：273.

[14] 孫嘯，王曄，何農(nóng)躍，等.生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用[J].生物物理學(xué)報(bào)，2001，17(1)：28-34.

[15] 王國建，戴樸，韓東，等.基因芯片技術(shù)在非綜合征性耳聾快速基因診斷中的應(yīng)用研究[J].中華耳科學(xué)雜志，2008，6(1)：61-65.

[收稿2014-10-22;修回2014-12-21]

(編輯：譚秀榮)

The mRNA expression of the AS signaling pathway related genes in the liver of hyperlipidemia rats by PCR array technology

ZhuMeilin,JiaLianqun,ChenYang,CaoYuan,LiNing,LiJing

(Key Laboratory of Ministry of education, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang Liaoning 110032,China)

Objective To test the mRNA expression of AS signaling pathway related genes in the liver of hyperlipidemia rat by the method of PCR array, and to explore the relationship between the above-mentioned changes in gene expression and hyperlipidemia.Methods SD rats (30 males) were randomly divided into two groups: control group and model group. The rats in model group were fed with high fat diet. The content of TG, TC, HDL-C and LDL-C in serum were detected by automatic biochemical analyzer. HE and oil red staining method were used to observe the liver injury. Total RNA was extracted from liver in each group. PCR array was used to test the AS signaling pathway related genes in the liver.Results In model group the level of TC and LDL-C increased while the level of HDL-C decreased significantly compared to control group. Oil red staining indicated that obvious lipid deposition were formed in the liver cells in model group. DNA microarray showed that in model group the expression level of 49 (55%) genes (e.g. Serpinb2 (PAI-2), Il2, Fga, Il5, Il4, Tnf, Cd44, Bid, Vwf, Mmp3, Icam1, Apob, etc.) increased by more than 2-fold compared to control group; and the expression level of 20 (22%) genes (e.g. Tgfb1,Vegfa,Lpl,Sod1,Fas,Pparg, etc.) decreased by more than 50% compared to control group.Conclusion The mRNA expression of AS related genes may relate to the hyperlipidemia.

cholesterol;hyperlipidemia; PCR array technology;liver;signal transduction

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(NO：81202834)；沈陽市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(NO：F12-277-1-49)。

賈連群，女，博士后，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥防治心血管疾病分子生物學(xué)機(jī)制，E-mail:jlq-8@163.com。

R589.2

A

1000-2715(2015)01-0037-04