精制胃樂(lè)膠囊長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究

姚觀平，余麗梅，范振海，吳 芹

(遵義醫(yī)學(xué)院 1.貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

精制胃樂(lè)膠囊長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究

姚觀平1,2,3，余麗梅1，范振海1，吳 芹2

(遵義醫(yī)學(xué)院 1.貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,貴州 遵義 563099)

目的 通過(guò)SD大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)觀察精制胃樂(lè)膠囊(rWLC)可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，以評(píng)價(jià)rWLC的安全性，為臨床安全用藥提供依據(jù)。方法 120只SD大鼠隨機(jī)分為4組(空白組、rWLC高、中、低劑量組)，每組30只，3個(gè)給藥劑量組分別為4.00、1.41和0.50 g·kg-1·d-1(分別是成人臨床日用量50 mg·kg-1·d-1的80、28和10倍)，每天灌胃1次，連續(xù)給藥90 d。停藥日及14 d后，分別檢測(cè)大鼠體重、血液學(xué)和血液生化指標(biāo)，計(jì)算重要臟器指數(shù)，并進(jìn)行組織病理檢查。結(jié)果 與空白組比較，rWLC 3個(gè)劑量組對(duì)大鼠的一般狀況、體重、血液學(xué)、血液生化指標(biāo)、重要臟器指數(shù)和臟器組織結(jié)構(gòu)等均未見(jiàn)明顯改變。停藥14 d后，檢測(cè)rWLC 3個(gè)組大鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)也未見(jiàn)明顯異常。結(jié)論 長(zhǎng)期大劑量連續(xù)灌胃給予rWLC，對(duì)大鼠無(wú)明顯毒性作用，停藥14 d后也未見(jiàn)藥物的延遲性毒性反應(yīng)，表明該藥臨床擬用劑量安全，未見(jiàn)明顯長(zhǎng)期毒性。

精制胃樂(lè)膠囊；長(zhǎng)期毒性；大鼠

精制胃樂(lè)膠囊(refine Wei Le capsule，rWLC)由白芍、蒼術(shù)、元胡、肉桂等6味中藥組成，源于貴州省黔東南地區(qū)，在原胃樂(lè)散的組方和炮制工藝基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥物制劑工藝研制而成的新制劑，采用原方精制、水提、醇提，按工藝1、工藝2、工藝3分別將其命名為rWLCI、rWLC2和rWLC3。其中工藝1生產(chǎn)的rWLC對(duì)消化性潰瘍療效最佳，可通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，保護(hù)黏膜，促進(jìn)損傷修復(fù)。具有溫中和胃、降逆止嘔、解痙之功效，用于氣滯所致胃脘疼痛，腹脹納差，反酸噯氣等癥。我們前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍有較好的防治作用。為保證臨床用藥的安全性，我們按療程進(jìn)行了90d及停藥14 d后的大鼠毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究[1-2]，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用清潔級(jí)SD大鼠120只，體重130～150g，雌雄各半，購(gòu)于購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005，合格證號(hào):0004256。

1.1.2 藥物 rWLC主要按胃樂(lè)散原方精制(原生粉過(guò)80目篩)，由遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室與貴陽(yáng)春科藥物研發(fā)股份有限公司聯(lián)合研制而成。實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配制所需濃度的混懸液，并能保持較好的流動(dòng)性及可操作性，可配制最大濃度為0.2 g/mL[5-6]。

1.1.3 主要儀器 電子分析天平為北京賽多利斯電子天平有限公司，Leica光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica 公司)，全自動(dòng)全血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex,XE-2100)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)ADVIA2120)和全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus,AU5421)。

1.2 方法 取SD大鼠120只，按體重隨機(jī)分為4組，每組30只，雌雄各半。rWLC高、中、低劑量組分別為4.00、1.41、0.50 g·kg-1·d-1,給藥體積均為10 ml·kg-1；空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，定時(shí)灌胃1次/d,給藥6d/周，稱量體重1次/周，每日觀察大鼠外觀體征、行為、飲食、呼吸、二便、皮毛光澤等一般情況，于第90天各組隨機(jī)麻醉15只大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分別送遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用全自動(dòng)全血細(xì)胞分析儀和全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血液學(xué)、血液生化指標(biāo)，稱重法稱量大鼠體重和臟器重量，計(jì)算臟器指數(shù)，留取各類組織器官標(biāo)本，送遵義醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室切片、染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。各組剩余大鼠停藥14 d，按照新藥注冊(cè)要求和有關(guān)文獻(xiàn)方法對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)[3-4]。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 連續(xù)灌胃給藥9d過(guò)程中，rWLC各給藥組與空白組大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便等狀況均正常；停藥14 d后，亦未見(jiàn)異常，說(shuō)明rWLC連續(xù)灌胃給藥90 d，對(duì)大鼠一般狀況無(wú)明顯毒性反應(yīng)。

2.2 體重變化 連續(xù)灌胃給藥90 d和停藥后14 d過(guò)程中，各劑量組不同性別大鼠隨著時(shí)間延長(zhǎng)體重逐漸增加，且各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

圖1 rWLC給藥90 d和停藥14 d后對(duì)雌(B)雄(A)大鼠體重的影響

2.3 血液學(xué)指標(biāo)變化 大鼠連續(xù)服用rWLC 90d過(guò)程中和停藥14 d，分別檢測(cè)rWLC高、中、低劑量組大鼠血液中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞容積(HCT)、平均紅細(xì)胞容積(MCV)、凝血酶原時(shí)間(PT)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(Ret)等血液學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：除給藥90 d后雌性低劑量組Hb、MCHC含量較空白組明顯增高(P<0.01)，但無(wú)劑量依賴關(guān)系，高、中劑量組未見(jiàn)明顯改變，其他各劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與空白組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；停藥14 d中、低劑量雄性大鼠WBC、RBC、PT、Ret計(jì)數(shù)較空白組明顯增加(P<0.01)，但無(wú)劑量依賴關(guān)系，其他各劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與空白組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1～2)。綜上所述，以血象觀察rWLC未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。

表1 rWLC給藥90 d對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(n=8)

組別性別WBC/×109·L-1RBC/×1012·L-1Hb/g·L-1PLT/×109·L-1PT/s空白組♀5．95±3．037．73±0．43146．14±7．52876．43±57．6912．12±1．58♂11．27±3．339．23±0．52166．50±9．73822．80±94．7217．15±0．78高劑量♀9．96±2．347．96±0．49148．29±5．22890．71±75．1811．13±1．80♂11．39±4．649．00±0．83156．60±14．94846．00±97．3717．70±0．89中劑量♀6．62±3．888．22±0．29153．80±4．60848．67±99．35 16．62±0．70??♂10．52±4．678．90±0．59159．83±9．13919．33±73．39 12．08±0．88??低劑量♀6．77±1．548．09±0．21 156．00±3．12??925．88±48．0911．83±2．35♂9．19±2．849．19±0．28 159．29±20．11738．80±95．6017．23±1．11

與空白組比較，**P<0.01。

表2 rWLC停藥恢復(fù)期14 d大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化(n=7)

組別性別WBC/×109·L-1RBC/×1012·L-1Hb/g·L-1PLT/×109·L-1PT/s空白組♀5．96±1．778．31±0．66154．00±7．54860．60±70．8415．58±0．44♂17．96±2．758．39±0．77159．00±4．55713．75±85．8817．26±0．62高劑量♀7．52±1．298．81±0．68163．75±8．66864．40±93．1115．84±0．98♂19．76±1．438．17±0．76159．67±12．90823．50±27．5818．20±0．42中劑量♀7．64±2．637．47±0．21147．25±6．19872．25±54．8316．83±0．81?♂9．75±3．18??8．99±0．43167．00±10．27816．75±83．3017．10±0．40?低劑量♀7．89±0．998．10±0．64158．00±4．85898．00±34．5816．45±0．66♂8．49±2．67??9．58±0．48??175．67±7．99??811．75±81．3916．37±1．62

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 血液生化學(xué)指標(biāo)變化 大鼠連續(xù)用rWLC 90d過(guò)程中和停藥恢復(fù)14 d，檢測(cè)其血清鉀離子濃度(K+)、鈉離子濃度(Na+)、氯離子濃度(Cl-)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT/U·L-1)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST/U·L-1)、堿性磷酸酶(ALP/U·L-1)、總膽紅素(T-BIL/μmol·L-1)、總蛋白(TP/g·L-1)、白蛋白(ALB/g·L-1)、尿素氮(BUN/mmol·L-1)、肌酐(Cr/μmol·L-1)、甘油三酯(TG/mmol·L)、總膽固醇(T-CHO/mmol·L-1) 、血糖(GLU/mmol·L-1)等指標(biāo)水平。結(jié)果：給藥90 d后雌性高劑量組TP、BUN，中劑量ALP、GLU，低劑量BUN有所升高(P<0.01)，但各劑量組數(shù)值均在正常范圍，且無(wú)劑量依賴關(guān)系，故認(rèn)為rWLC給藥90d對(duì)各項(xiàng)血液生化指標(biāo)沒(méi)有明顯影響。停藥后14d，高、中、低劑量rWLC各組與空白組比較Cl-、AST 、ALP、CREA、GLU有一定升高(P<0.01)，但各劑量組數(shù)值也均在正常值范圍，且無(wú)組間差異，故認(rèn)為停藥后的升高是正常范圍波動(dòng)。提示rWLC對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)沒(méi)有明顯毒性改變(見(jiàn)圖2)。

2.5 重要臟器指數(shù)的變化 大鼠連續(xù)服用rWLC 90d和停藥14d，留取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪等重要要臟器組織，肉眼觀察其大小、形狀、色澤、質(zhì)地、包膜等與空白組比較均無(wú)異常改變，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。結(jié)果:給藥90d后，可見(jiàn)雌性大鼠中劑量肝、胸腺，低劑量脾臟臟器指數(shù)明顯增加，但無(wú)明顯肝臟功能及血象改變，各組臟器指數(shù)均在正常范圍；停藥14 d，雌性高劑量卵巢、肝，中劑量脾臟臟器指數(shù)明顯增大(P<0.01)；雄性高劑量腦、睪丸臟器指數(shù)明顯增大，而高劑量腎上腺、低劑量胸腺以及中、低劑量肺臟器指數(shù)反而降低(P<0.01)，但這些升降變化與劑量均未顯示劑量依賴關(guān)系，各組的臟器指數(shù)也均在正常范圍(見(jiàn)表3～4)。上述變化仍屬正常波動(dòng)范圍。提示rWLC對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)無(wú)明顯影響。

A:rWLC給藥90 d對(duì)雌性大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)影響；B：rWLC給藥90 d對(duì)雄性大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)影響;C：rWLC停藥恢復(fù)期14 d雄性大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)變化。D：rWLC停藥恢復(fù)期14 d雄性大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)變化。與空白組比較，*P <0.05，**P <0.01。

表3 rWLC對(duì)給藥90d大鼠主要臟器指數(shù)的影響(n=8)

組別性別 心 肝 脾 肺 腎 腦空白組高劑量中劑量低劑量♀0．33±0．022．96±0．230．19±0．030．61±0．050．64±0．070．74±0．07♂0．25±0．013．22±0．300．17±0．020．55±0．090．64±0．060．49±0．08♀0．35±0．033．13±0．210．22±0．030．65±0．050．67±0．060．79±0．07♂0．27±0．023．57±0．250．15±0．020．54±0．060．72±0．060．53±0．03♀0．30±0．013．83±0．25??0．23±0．060．58±0．030．60±0．020．68±0．03♂0．28±0．013．01±0．150．16±0．040．53±0．090．71±0．080．52±0．09♀0．32±0．022．95±0．200．58±0．09??0．64±0．060．68±0．060．75±0．07♂0．28±0．023．07±0．300．16±0．030．50±0．040．63±0．030．50±0．07

與空白組比較，**P<0.01。

表4 rWLC停藥恢復(fù)期14 d大鼠主要臟器指數(shù)的變化(n=7)

組別性別 心 肝 脾 肺 腎 腦空白組高劑量中劑量低劑量♀0．35±0．032．80±0．040．22±0．020．57±0．040．64±0．040．76±0．07♂0．30±0．022．76±0．320．30±0．050．66±0．060．67±0．070．47±0．05♀0．33±0．023．14±0．21??0．24±0．060．60±0．020．68±0．050．78±0．05♂0．32±0．012．80±0．130．30±0．100．56±0．080．74±0．04 0．59±0．03??♀0．34±0．052．95±0．150．54±0．06??0．60±0．050．63±0．040．79±0．07♂0．30±0．032．81±0．140．31±0．080．52±0．06??0．72±0．060．50±0．05♀0．33±0．012．93±0．230．19±0．010．58±0．060．64±0．030．78±0．04♂0．28±0．012．60±0．110．24±0．080．53±0．04??0．73±0．040．55±0．07

與空白組比較，**P<0.01。

2.6 各臟器組織病理學(xué)變化 HE染色，各重要臟器和組織病理檢查結(jié)果顯示，rWLC給藥90d和停藥14d后，各組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦(大腦、小腦、腦干) 、垂體、脊髓(頸、胸、腰段) 、骨髓、腎上腺、甲狀腺、甲狀腺旁腺、胸腺、唾液腺、食管、氣管、主動(dòng)脈、胃腸(大腸、小腸) 、胰、膀胱、子宮、卵巢、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)、乳腺、睪丸、附睪、前列腺等臟器的肉眼和組織病理學(xué)檢查均未見(jiàn)明顯異常，與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

A：空白組；B：rWLC高劑量組；1：心?。?：肝臟；3：脾；4：肺；5：腎。

3 討論

以往的研究表明，原方胃樂(lè)散及rWLC對(duì)消化性潰瘍及急性化膿梗阻性膽管炎等具有明顯治療效果[6-7]，按照參照急性毒性實(shí)驗(yàn)最大耐受劑量及其治療有效劑量和消化性潰瘍用藥劑量的療程[8]，rWLC慢性毒性實(shí)驗(yàn)中給藥劑量為4.00、1.41和0.50 g·kg-1·d-1，分別相當(dāng)于成人臨床用量80、28和10倍(臨床用藥劑量為50mg·kg-1·d-1)，連續(xù)灌胃給藥90d和停藥恢復(fù)14 d，觀測(cè)rWLC個(gè)劑量組與空白組正常大鼠一樣，一般狀況良好，體重逐漸正常增長(zhǎng)[9-10]；血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查各項(xiàng)指標(biāo)及臟器指數(shù)，給藥組與空白組之間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明rWLC長(zhǎng)期大劑量用藥未見(jiàn)明顯的血液系統(tǒng)、肝腎肺及腸功能異常；心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器和胃腸、多種腺體、生殖泌尿及骨和骨髓等組織也未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變及延遲性毒性，進(jìn)一步確證了rWLC未見(jiàn)明顯慢性毒性，表明同許多臨床已經(jīng)應(yīng)用的中藥復(fù)方制劑一樣，rWLC按臨床擬用的劑量、途徑及療程應(yīng)用其安全性較為可靠。

[1] 徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:231-232．

[2] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥天然藥物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[S].國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局,2005．

[3] 王菊鳳,楊道德,李鵠鳴.蛹蟲(chóng)草富鍺胞外多糖對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014,30(9):1329-1330.

[4] 馬曉玲，魏鴻雁，賈曉光，等.駱駝刺膠囊對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性[J].中藥藥理與臨床,2014, 30(2)：113-115.

[5] 余麗梅,鄧江,文國(guó)容,等．胃樂(lè)膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍的作用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,24(5): 388-399．

[6] 王雨波，余麗梅，姚觀平，等. 精制胃樂(lè)膠囊促進(jìn)大鼠乙酸性胃潰瘍修復(fù)的作用與機(jī)制[J].中成藥,2014,36(7):1533-1535.

[7] 舒濤，范振海，吳芹，等.胃樂(lè)散治療急性化膿性梗阻性膽管炎的實(shí)驗(yàn)研究[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,32(11):1235-1236.

[8] 姚觀平，余麗梅，楊平花，等. 精制胃樂(lè)膠囊的抗炎鎮(zhèn)痛作用與急性毒性研究[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,36(6):511-514.

[9] 朱斌，蔣平，楊陽(yáng),等.養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2014,34(3):181-186.

[10] 徐步強(qiáng)，黃正明，李瑞生,等.水芹總酚酸膠囊對(duì)Wistar大鼠的長(zhǎng)期毒性研究[J].中藥藥理與臨床, 2014,30(2):82-86.

[收稿2014-07-11;修回2014-12-12]

(編輯：譚秀榮)

Chronic toxicity experimental study of refined wei le capsule in rats

YaoGuanping1，2，3，YuLimei1，2，F(xiàn)anZhenhai1，WuQin2

(1. The Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province；2.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3. Human Reproductive Medicine Center,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China)

Objective To evaluate the safety of refined wei le capsule (rWLC) and to provide evidence for the clinical safely drug-use through long-term toxicity test in rats .Methods 120 SD rats were randomly divided into 4 groups (control group，high，middle and low dosage of rWLC groups)，30 rats in each group．Rats were treated with rWLC at three doses of 4.00, 1.41, and 0.50 g·kg-1·d-1(equivalent to 80, 28 and 10 times of adult clinic daily dose of 0.05 g·kg-1·d-1) by gavage, once a day for 90 days. The body weights, the indexes of hematology and biochemistry, organ weight index, and the pathological examination were measured at 90 days of administration and 14 days after stopping the medicine, respectively .Results The general animal health body weights，the indexes of hematology and biochemistry，organ weight index，and pathological examination of major organs of rats had no significant difference comparing with control group after 90 days of administration;14 days after stopping the medicine, no evident abnormal changes of above indexes were observed in administration groups.Conclusion rWLC has no significant toxicity or delayed toxicity after long-term of high dosage continuous oral gavage in rats, which indicates that the clinic dose is safe.

refine wei le capsule ；long-term toxicity；rat

貴州省科技廳中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)(NO:黔科合社字[20085023])。

余麗梅，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:ylm720@sina.com。

R251

A

1000-2715(2015)01-0032-05