人胃癌HGC-27裸鼠皮下移植瘤模型的建立

靳俊峰,歐小波,阮 媛,郭瑞珍

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 病理學教研室， 廣東 珠海 519041 )

基礎醫(yī)學研究

人胃癌HGC-27裸鼠皮下移植瘤模型的建立

靳俊峰,歐小波,阮 媛,郭瑞珍

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 病理學教研室， 廣東 珠海 519041 )

目的 建立人胃癌細胞株HGC-27裸小鼠皮下移植瘤模型，為胃癌的研究提供簡單實用的載體。方法 培養(yǎng)HGC-27人胃癌細胞，達106～107個活細胞/瓶，以0.9%氯化鈉無菌水溶液為溶劑制成單細胞懸液，隨機注射到裸小鼠左腋下或右腋下，觀察腫塊的形成，并進行組織學觀察。結果 注射后8 d觸及米粒般大小的腫塊，14 d可見腫塊明顯隆起。組織學觀察癌細胞無腺體樣結構形成，呈片狀、巢狀或條索狀排列，細胞形狀不規(guī)則，呈圓形、梭形或不規(guī)則形，核大深染，核質(zhì)比增高，可見核分裂象。結論 人胃癌細胞株HGC-27裸小鼠皮下移植瘤模型的建立，操作簡便，腫塊表淺，可直接觀測腫瘤，為進一步的研究能提供簡單有效的模型。

胃癌；裸鼠；細胞株；移植瘤模型

胃癌是危害我國居民身體健康的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居于所有惡性腫瘤的前列[1]。由于人的胃癌標本相對難以獲得，受時間、空間、社會、倫理等諸多因素的限制，故動物實驗就成為研究胃癌的重要手段之一。通過動物實驗可以方便地獲得大量實驗材料，從而為下一步的實驗提供有效的研究載體。胃癌動物模型的建立就成為開展研究的先決條件，目前，胃癌動物模型的建立方法主要有誘導致瘤法和移植瘤法[2]，

其中皮下誘導致瘤法操作相對簡便，因此本實驗以裸小鼠的皮下誘導致瘤模型的建立為研究對象，為胃癌的基礎和臨床研究提供可靠實用的動物模型制作方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌細胞株 HGC-27人胃癌細胞,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 實驗動物 BALB/c-nu/nu裸小鼠:購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2014-0004。雄性4～5周齡,體重16～18g。實驗過程均在SPF屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。實驗前1周購入小鼠,使之適應新環(huán)境。

1.1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞HGC-27(見圖1)轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液中,在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后,用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個細胞,繼續(xù)傳代。經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)后，整個細胞鋪滿瓶底，采用細胞計數(shù)板計數(shù)，取生長期細胞數(shù)在106～107個活細胞進行實驗。

1.2.2 制備單細胞懸液 在超凈工作臺內(nèi)按照無菌操作規(guī)則進行，用0.25%胰蛋白酶進行消化，輕輕振蕩搖晃，在顯微鏡下觀察大多數(shù)細胞由長梭形變?yōu)閳A形時，加入含血培養(yǎng)液，終止消化。吸管輕輕吹打整個瓶底，收集細胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000轉(zhuǎn)/min，離心5 min。棄上清，加入0.9%氯化鈉無菌水溶液0.3 mL,重新懸浮，并移入eppendorf管中，密封置于冰盒備用。

1.2.3 皮下移植瘤模型建立 在超凈工作臺中按照無菌操作規(guī)則進行，無菌注射器(1.0 mL)抽出eppendorf管中的單細胞懸液，隨機將裸鼠的左腋下或右腋下皮膚用碘酒、酒精局部消毒，提起皮膚，扎入皮下，有落空感時，即進入皮下組織。輕輕刺入深部，使整個針頭進入皮下，注入液體，完畢后旋轉(zhuǎn)針筒退出，輕輕按壓，防止液體滲出。飼養(yǎng)，觀察并測量腫瘤形成情況，整個環(huán)節(jié)均在 SPF 屏障環(huán)境內(nèi)進行。

1.2.4 大體觀察和組織學觀察 定時觀察所有裸鼠全身狀況、運動情況、左腋下和右腋下體征。至第8周脫頸處死解剖,取原位瘤。所取標本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色, 光鏡下觀察瘤體組織結構。

2 結果

左腋下或右腋下注射HGC-27胃癌細胞株后，裸小鼠生存狀態(tài)良好，活躍，局部組織無明顯炎癥反應和全身不良反應。注射后第8天，可于左腋下或右腋下觸及約米粒般大小之硬質(zhì)腫塊，14 d觀察到左腋下或右腋下有一腫塊局部隆起(見圖2、圖3)，與局部組織有粘連，不易推動，瘤體大小不等，表面凸凹不平。隨著腫瘤的逐漸增大，動物明顯消瘦，活躍度下降。將裸鼠脫頸處死后，將腫塊取下，發(fā)現(xiàn)腫塊與上肢及胸部組織粘連緊密，不易剝離，呈灰白色，表面有出血，沿最大徑切開，中央有灰黑色的壞死區(qū)(見圖4)。組織學觀察可見胃癌細胞無腺體樣結構形成，呈片狀、巢狀或條索狀排列，細胞形狀不規(guī)則，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，核大深染，核質(zhì)比增高，可見核分裂象及病理性核分裂象(見圖5、圖6)。操作的過程中，如果有液體的滲出，則長出的腫瘤體積較小，出現(xiàn)時間較晚。

3 討論

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其機制尚未明確[3]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多基因參與的復雜過程[4]，其發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤的前列，嚴重危害我國居民的身體健康。因此,建立能夠真實模擬臨床胃癌的理想動物模型，對于深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展及尋找新的治療方法具有重要的意義。

人胃癌裸鼠移植模型經(jīng)歷了細胞懸液皮下接種、細胞懸液胃壁處接種及完整組織塊胃壁內(nèi)移植3個代表性階段。其中腫瘤細胞懸液注射裸鼠胃壁形成的原位移植模型最易發(fā)生類似人類腫瘤的轉(zhuǎn)移過程[5],但實驗研究發(fā)現(xiàn)皮下移植塊原位移植法局部成瘤率和轉(zhuǎn)移發(fā)生率較細胞懸液原位種植高,生長較細胞懸液原位種植法快2～3周[6]。原位移植成功率、轉(zhuǎn)移率、荷瘤鼠中位生存期等指標均很高,能更好的模擬臨床胃癌病人疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[7-8]。然而腫瘤細胞懸液皮下接種法，操作簡單，方便易行，形成的腫塊位置表淺，可直接觀測到腫瘤的生長，在一定的條件下也能夠滿足研究之所需。

本實驗發(fā)現(xiàn)胃癌裸鼠模型的成功建立可能與以下因素有關：①注射的細胞量：注射到裸鼠皮下的胃癌細胞數(shù)量最少應達106～107個活細胞[9]，當細胞長滿培養(yǎng)瓶底時，可用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，通過多次觀察發(fā)現(xiàn)，25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶，長滿細胞時即可達到該要求，細胞數(shù)目過多，造成浪費，過少則腫瘤不會生長；②裸鼠的選擇：腫瘤的不同造成適宜的動物模型亦不同，如果沒有特殊要求，一般選擇BALB/c-nu/nu裸小鼠作為造模動物，鼠齡4～5周[10]，體重18～22g,對腫瘤細胞的耐受和免疫反應均較好;裸鼠性別一般選擇同種性別，即雄性裸鼠或者雌性裸鼠，不宜同時采用雌雄裸鼠，可能引起混籠，形成孕鼠，影響實驗；③注射部位的選擇：常見的皮下注射部位為左腋下或右腋下，由于該處部位隱蔽，小鼠不易啃食或抓撓；也可以選擇頸部下方和雙肩部上方的部位，但是由于離頸部較近，當腫瘤巨大時可能會壓迫氣管，影響呼吸；④單細胞重懸液的選擇：離心后將離心管上方的培養(yǎng)液棄去，管底的細胞一般選用0.9%氯化鈉無菌水溶液重懸，如用細胞培養(yǎng)液易引起排斥反應，且重懸后液體的體積最好在0.3mL左右，過多可從針孔流出；⑤操作方法的影響：注射部位用酒精碘酒局部消毒后，戴無菌手套的左手輕輕提起皮膚，右手的皮試注射器(1 mL)垂直于皮膚刺入,落空感時，即進入皮下組織，向深部進針，至腋下后緩緩推出針筒，并慢慢旋轉(zhuǎn)退出，完全退出皮膚后，輕輕按壓針孔，防止液體流出；⑥單細胞重懸液的保存：一次皮下注射的裸鼠數(shù)量較多時，制備單細胞懸液耗費時間較長，須把eppendorf管插入冰盒保存，防止細胞死亡。

總之，皮下注射的方法及注射量等多種因素都會影響腫塊的形成，從而決定胃癌裸鼠模型建立的成功與否。比如注射方法不正確，會引發(fā)液體地滲出，導致皮下注射細胞量不足，進而影響成瘤的速度和瘤塊的大小，即注射有滲出時，成瘤速度慢腫塊小，反之，則成瘤速度快而腫塊大。腫塊的大小、生長速度等受多種因素的影響，與裸鼠個體差異、注射細胞量、測量方法、時間等密切相關，重復性較差。

當然，腫瘤細胞懸液的皮下接種法與真實的臨床胃癌還有一定的差異，但是可從某種程度上部分模擬胃癌，具有一定的應用價值。細胞懸液胃壁處接種法和完整組織塊胃壁內(nèi)移植法，從理論上講，具有更好的相似生長微環(huán)境，能夠更好的反映胃癌的生物學特性，但是操作復雜，要求較高。根據(jù)不同的研究目的，可選用不同的胃癌模型建立方法。

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[收稿2014-10-09;修回2014-12-10]

(編輯：譚秀榮)

Establishment of a xenograft model in nude mice with human gastric cancer HGC-27 cells

JinJunfeng,OuXiaobo,RuanYuan,GuoRuizhen

(Department of Pathology, Zunyi Medical University Zhuhai Campus,Zhuhai Guangdong 519041,China)

Objective To establish a subcutaneous tumor xenograft model in nude mice by injection of human gastric carcinoma HGC-27 cells and to provide references to related researches.Methods HGC-27 cell line was cultured and made into single-cell suspension of 106～107in normal saline . HGC-27 cells were injected subcutaneously into nude mice. The oncogenesis was observed and the organization structure was observed through light microscope.Results The tumors were not observed till the 8th day of injection, but solid granule-like mass could be felt. The oncogenesis was evident at the 2nd week. Under the light microscope, the morphology of HGC-27 transplanted tumors show the characteristic of cancer.Conclusion The transplanted tumor model of HGC-27 cell in nude mice is established successfully.It provides a foundation for the experimental studies of gastric carcinoma.

gastric carcinoma;nude mice; HGC 27 cell line; xenograft model

貴州省衛(wèi)生廳科學技術基金資助項目(NO：gzwkj2010-1-015);遵義醫(yī)學院碩士啟動項目(NO:F-355)。

R735.2

A

1000-2715(2015)01-0029-03