篩選小鼠Cltb 啟動子順式元件結(jié)合蛋白的酵母單雜交文庫的構(gòu)建

呂學(xué)軍 陸衛(wèi)忠 張永娟 郭 亮 李少瑩 李玉英 錢桂生

·論著·

篩選小鼠Cltb 啟動子順式元件結(jié)合蛋白的酵母單雜交文庫的構(gòu)建

呂學(xué)軍1陸衛(wèi)忠1張永娟2郭 亮1李少瑩1李玉英1錢桂生1

目的利用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與Cltb基因啟動子結(jié)合的順式元件，獲得調(diào)控Cltb基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，闡明Cltb基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理。方法首先，構(gòu)建表達(dá)Cltb調(diào)控序列的誘餌質(zhì)粒pBait-AbAi，并將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y1HGold菌株，構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)“誘餌-報(bào)告子”的酵母菌株；然后，運(yùn)用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建小鼠肺組織酵母單雜交cDNA AD融合表達(dá)文庫，并進(jìn)行cDNA文庫的篩選。結(jié)果成功構(gòu)建了篩選Cltb啟動子順式元件結(jié)合蛋白的酵母單雜交文庫，該文庫的轉(zhuǎn)化效率為：9.35×105CFU/μg。通過對文庫的篩選最后獲得了5個陽性克隆并測序，得到5個可編碼結(jié)合蛋白的基因，分別是Srrt、hnRNPs A/B、Irf1、NKx2.5和Zfp953。結(jié)論所構(gòu)建的酵母單雜交文庫符合實(shí)驗(yàn)要求，篩選的5個轉(zhuǎn)錄因子為研究Cltb基因表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

Cltb基因； 酵母單雜交文庫； 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)與急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是當(dāng)前危重疾病領(lǐng)域最為重視的研究熱點(diǎn)之一。長期以來，國內(nèi)外學(xué)者對該病進(jìn)行了大量研究，但迄今為止ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1]。肺泡上皮細(xì)胞為典型的極性細(xì)胞，細(xì)胞極性的變化與分泌功能、液體清除功能、膜通道等細(xì)胞功能密切相關(guān)。研究證實(shí)，ALI/ARDS時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞存在極性損傷，而這種極性損傷在ALI/ARDS早期扮演重要角色。

新近研究發(fā)現(xiàn)Clathrin蛋白是維持上皮細(xì)胞基底的胞外側(cè)質(zhì)膜極性所必須的重要蛋白。Clathrin基因的沉默會干擾基底外側(cè)蛋白的運(yùn)輸和再循環(huán)從而使其失去極性，但是對頂端蛋白的極性沒有影響[2]。Clathrin蛋白對于上皮細(xì)胞的極性維持和調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用，但其上游的調(diào)控機(jī)制仍不明確。分離Clathrin蛋白上游相關(guān)調(diào)控基因，對于闡明細(xì)胞極性調(diào)控機(jī)制具有重要價(jià)值[3]。

本研究應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)從小鼠肺cDNA文庫中篩選與Cltb基因啟動子順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，旨在進(jìn)一步闡明Clathrin蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

一、誘餌序列的設(shè)計(jì)

構(gòu)建表達(dá)Cltb調(diào)控序列的誘餌質(zhì)粒pBait-AbAi，同時(shí)構(gòu)建表達(dá)Cltb突變調(diào)控序列的pMutant-AbAi作為確定陽性克隆特異性的陰性對照質(zhì)粒。根據(jù)小鼠Cltb 基因編碼區(qū)上游的基因組調(diào)控序列，通過在線預(yù)測軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(啟動子序列)，進(jìn)一步預(yù)測TFBS(轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))，最終選擇以下序列作為誘餌序列，全長430bp，同時(shí)設(shè)計(jì)了突變誘餌序列，紅色下劃線區(qū)域?yàn)橥蛔冃蛄校?/p>

誘餌序列

GGAAAACCAAAAAACTGAGTGAACAGAGTTGA

CTGGAGAGGGAGCAGAGGTCCTAAACCAATTCAAT

TCTGAAAAACCACATGAAGGCTCACAGCCATTTGCA

CAGCTACAGTGTCCTCACATAAATATATAAATAAAT

AAAAAAATTTCAAGTGGGGGAGGGGAACTGTTAGG

GAGGGGATACCTGGGAGGCGTGAGATATGTGAGGG

GGGAGCATATGCTCAAAATGCATTACTTGTTTGTAT

AAAATGACAAAGAGGGCTGTAGAGATGGCTCAGTG

GTTAAGAGCACTGACTGCTCTTCCAGAGGTTCTGAG

TTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCA

TCTGTGATGTGATCTTGGTGCCTTCTTCTGTCCTACA

GGCATATATGCAGGCAGAACACTGTATACATAATAT

ATATA

突變誘餌序列

GGAAAACCAAAAAACTGAGTGAACAGAGTTGA

CTGGAGAGGGAGCAGAGGTCCTAAACCAATTCAATT

CTGAAAATGGTCTTGAAGGCTCACAGCCATTTGCAC

AGCTACAGTGTCCTCACTATTTCATTATTTCAAATAA

AAAAATTAGTACACGGGGAGGGGAACTGTTAGGGA

GGGGATACCTGGGAGGCGTGAGATATGTGAGGGGG

GAGCATATGCTCAAAATGCATTACTTGTTTGTATAA

AATGACAAAGAGGGCTGTAGAGATGGCTCAGTGGT

TAAGAGCACTGACTGCTCTTCCAGAGGTTCTGAGTT

CAATTCCCAGCATGGTCTTGGTGGCTCACAACCATC

TGTGATGTGATCTTGGTGCCTTCTTCTGTCCTACAGG

CATATATGCAGGCAGAACACTGTATACATAATATAT

ATA

分別全基因合成誘餌序列和突變誘餌序列，序列克隆至PES載體，5′端和3′端分別加上Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

二、重組誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

PES/Bait， PES/mu-Bait， pAbAi載體用Hind Ⅲ和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物上樣至1% Agarose gel，電泳至適當(dāng)位置后，紫外燈下切膠回收。PES/Bait，PES/mu-Bait質(zhì)粒酶切產(chǎn)物回收430bp左右的誘餌片段，pAbAi載體回收5000 bp左右的載體線性化片段。對回收后的Bait，mu-Bait片段及pAbAi載體定量后，進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化后菌鋪至LB-Ampr+平板，37 ℃溫箱孵育過夜。挑取平板上長出的單克隆至LB-Ampr+液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 rpm，振蕩培養(yǎng)15 h，提取細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒并雙酶切鑒定。

三、構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)“誘餌-報(bào)告子”的酵母菌株

1. 線性化誘餌質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞： 對pAbAi/Bait，pAbAi/mu-Bait及p53-AbAi重組質(zhì)粒進(jìn)行BbsI酶切，將酶切的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入Y1HGold菌株，通過同源重組整合進(jìn)入酵母基因組，在SD/-Ura平板上篩選酵母轉(zhuǎn)化子。以酶切的誘餌突變質(zhì)粒pAbAi/mu-Bait作為陰性對照，酶切的質(zhì)粒p53-AbAi 作為陽性對照。

2. 酵母誘餌報(bào)告子的PCR 鑒定： 分別挑取Y1HGold[pAbAi/Bait]、Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]和Y1HGold[p53-AbAi]酵母菌落于30 ℃培養(yǎng)過夜。PCR 鑒定反應(yīng)體系如下：25 μl重組菌液、Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 μl。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，30 cycles。預(yù)期的PCR 結(jié)果為：陽性組(p53-AbAi)PCR 產(chǎn)物大小應(yīng)為1.4 kb；陰性組(單純Y1HGold菌株)無條帶；誘餌及突變誘餌組(pAbAi/Bait，pAbAi/mu-Bait)：1.35 kb + 插入的誘餌片段大小(約1.8 kb)。

3. 酵母誘餌報(bào)告子的AbAr 最小抑制濃度測定： 分別挑選Y1HGold[pAbAi/Bait]、Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]和Y1HGold[p53-AbAi] 中大而健康的酵母菌落，每個菌落斑用0.9% 的NaCl 重懸(2000 個細(xì)胞/100 μl)。將100 μl 菌液分別涂布到以下培養(yǎng)基上：SD/-Ura、SD/-Ura /AbA(100 ng/ml)、SD/-Ura/AbA(200 ng/ml)和SD/-Ura/AbA(300 ng/ml)，然后于30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落的生長情況。

四、運(yùn)用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建小鼠肺組織酵母單雜交cDNA AD融合表達(dá)文庫

1.cDNA 第一鏈的合成: 將新鮮小鼠肺組織塊放置于液氮中，將組織磨成粉末后，加入Trizol提取總RNA，按照Trizol Reagent操作說明進(jìn)行。然后，用FastTrack?MAG mRNA isolation Kit從總RNA中分離mRNA。取純化并定量的mRNA 1 μl(～1.0 μg poly A+)，加入1μL CDSⅢ(oligo-dT)primer 和2 μl去離子水，72 ℃溫育 2 min 后置冰上，加入下列混合液：5×First-Strand Buffer 2 μl、DTT(100 mM)1 μl、dNTP mix(10mM)1 μl和SMART MMLV RT 1 μl，混勻后，42 ℃溫育10 min。加入1 μl BD SMART Ⅲ Oligo，混勻，42 ℃溫育1 h，75 ℃放置10 min終止反應(yīng)后降至室溫，加入1 μl RNase H(2 units)，37 ℃溫育20 min；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.運(yùn)用長距離PCR(LD-PCR)擴(kuò)增SMART cDNA: 建立以下反應(yīng)體系：SMART cDNA 第一鏈2 μl、去離子水70 μl、10×Advantage 2 PCR Buffer 10 μl、50×dNTP Mix 2 μl、5′PCR Primer 2 μl、3′PCR Primer 2 μl、Melting Solutiont 10 μl、50×Advantage 2 Polymerase Mix 2 μl?；旌暇鶆蚝?，運(yùn)行以下循環(huán)：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min (每運(yùn)行一個循環(huán)擴(kuò)增時(shí)間增加5 sec)，28 cycles；68 ℃ 5 min。

3.使用純化柱純化雙鏈cDNA: 利用BD CHROMA SPINTM-400 Columns純化雙鏈cDNA，以去除小片段。加入l/10 體積的3M NaAc 和2.5 體積的95%乙醇，-20 ℃沉淀1 h。700×g離心5 min，去上清，75%乙醇洗滌兩次后，干燥，無菌水溶解(100～150 ng/μl)，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

五、 酵母單雜交cDNA文庫篩選

分別制備酵母感受態(tài)細(xì)胞Y1HGold[p53-AbAi]和Y1HGold[pAbAi/Bait]。對于誘餌酵母菌株的轉(zhuǎn)化設(shè)定如下反應(yīng)體系：5 μg SMART 擴(kuò)增的雙鏈cDNA文庫、3 μg SmaI線性化的pGADT7-Rec質(zhì)粒、PGE/LiAc 2.5 ml、感受態(tài)細(xì)胞Y1HGold[pAbAi/Bait] 600 μl。對于p53陽性對照酵母菌株的轉(zhuǎn)化設(shè)定如下反應(yīng)體系：100 ng p53片段、1 μg SmaI線性化的pGADT7-Rec質(zhì)粒、PGE/LiAc 200 μl、感受態(tài)細(xì)胞Y1HGold[p53-AbAi] 50 μl。30 ℃溫浴4 min，混勻15 min/次。加入160 ml DMSO，42 ℃ 熱激30 min，混勻后700×g 離心5 min，去上清，用3 ml的YPDA液體培養(yǎng)基重懸。30 ℃ 250 rpm搖床培養(yǎng)90 min。700×g離心5 min，用15 ml 0.9% NaCl重懸。按 1/10、1/100 和 1/1000的比例對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別進(jìn)行稀釋，從3個稀釋液中各取 100 μl分別涂布在 SD/-Leu、SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)(文庫篩選) 和SD/-Leu/AbA(200 ng/ml)(p53陽性對照)平板上培養(yǎng)，用于計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。將剩余的文庫轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻鋪至150 mm SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)平板進(jìn)行篩選，每個平板鋪150 μl，30 ℃孵育3～5 d。計(jì)算篩選克隆總數(shù)。

六、陽性克隆的確認(rèn)及文庫質(zhì)粒的分離純化

1.將陽性克隆在新鮮選擇培養(yǎng)平板上重新劃線以確認(rèn)陽性表型: 將在篩選平板上長出的陽性克隆重新劃線接種至SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)平板上，2～4 d后長出單個菌落。將單個陽性克隆菌用PBS混懸后，再次接種至SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)上，觀察菌落的生長情況，仍然生長的克隆進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

2. PCR分析以排除重復(fù)克隆: 挑取直徑較大陽性單克隆，采用clontech 公司的Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 試劑盒初步鑒定陽性克隆。PCR 鑒定，反應(yīng)體系如下：25 μl酵母菌液、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 25 μl。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，30 cycles。

3. 分離和純化陽性文庫質(zhì)粒: 擴(kuò)增含有陽性克隆的酵母細(xì)胞后通過化學(xué)及物理裂解的方法提取其中的文庫質(zhì)粒DNA。通過轉(zhuǎn)化上述質(zhì)粒DNA至大腸桿菌后，分離純化文庫質(zhì)粒DNA。將100 ng陽性文庫質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入Y1HGold[pAbAi/Bait]、Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]菌株。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物按照1︰100稀釋后，分別接種至以下平板：SD/-Leu、SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)。30 ℃孵育3～5 d，觀察克隆生長情況。

結(jié) 果

一、重組誘餌質(zhì)粒的酶切鑒定

誘餌序列、突變誘餌序列和pAbAi載體進(jìn)行DNA連接反應(yīng)產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)菌，提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定，見圖1。

注：Lane 1-4為Bait克隆4酶切產(chǎn)物； Lane 5：DNA marker；Lane 6-9：mu-Bait克隆2酶切產(chǎn)物

結(jié)果顯示，AbAi/Bait和pAbAi/mu-Bait的1，2，3，4號克隆均為陽性克隆，各選取1號克隆送測序，測序結(jié)果顯示序列無誤。采用該克隆進(jìn)行后續(xù)的“誘餌-報(bào)告子”酵母菌株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。

二、酵母誘餌報(bào)告子的PCR鑒定

對pAbAi/Bait，pAbAi/mu-Bait及p53-AbAi重組質(zhì)粒進(jìn)行BbsI酶切，酶切的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入Y1HGold菌株，在SD/-Ura平板上篩選酵母轉(zhuǎn)化子并行PCR 鑒定，結(jié)果表明插入的誘餌序列、突變誘餌序列及插入方向完全正確，如圖2。

注：Lane 1：DNA marker；Lane 2：報(bào)告子Y1HGold[p53-AbAi]的菌液PCR 產(chǎn)物1.4 kb；Lane 3：報(bào)告子Y1HGold[pAbAi/Bait]的菌液PCR 產(chǎn)物(1.8 kb)；Lane 4：報(bào)告子Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]的菌液PCR 產(chǎn)物(1.8 kb)；Lane 5：單純Y1HGold菌液PCR 產(chǎn)物

三、酵母誘餌報(bào)告子的AbAr 最小抑制濃度測定

將酵母誘餌報(bào)告子菌液分別涂布到以下培養(yǎng)基上：SD/-Ura、SD/-Ura /AbA(100 ng/ml)、SD/-Ura/AbA(200 ng/ml)和SD/-Ura/AbA(300 ng/ml)，然后于30 ℃培養(yǎng)2～3天，觀察菌落的生長情況。最低抗性測定結(jié)果如圖3所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定酵母誘餌報(bào)告子的AbA 最小抑制濃度：以SD/-Ura AbA200 作為Y1HGold[p53-AbAi]陽性反應(yīng)的篩選條件；SD/-Ura AbA300 作為Y1HGold[pAbAi/Bait]的篩選條件。

圖3 酵母誘餌報(bào)告子的AbAr 最小抑制濃度測定

四、小鼠肺組織酵母單雜交cDNA文庫構(gòu)建

提取小鼠肺組織總RNA并純化分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成ss cDNA，再用LD-PCR擴(kuò)增合成ds cDNA，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明：經(jīng)純化后的SMART cDNA 片段大小主要分布于500～3000 bp 之間，呈現(xiàn)明亮的彌散狀條帶，符合文庫構(gòu)建要求，如圖4。

圖4 過柱純化的雙鏈cDNA

五、酵母單雜交cDNA文庫篩選

誘餌酵母菌和p53陽性對照酵母菌轉(zhuǎn)化后按 1/10、1/100 和 1/1000 的比例對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別進(jìn)行稀釋，從3個稀釋液中各取 100 μl分別涂布在 SD/-Leu、SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)(文庫篩選) 和SD/-Leu/AbA(200 ng/ml)(p53陽性對照)平板上培養(yǎng)，結(jié)果如圖5，轉(zhuǎn)化效率為：187×50×100=9.35×105。將剩余的文庫轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻鋪至150 mm SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)平板進(jìn)行篩選，每個平板鋪150 μl，30 ℃孵育3～5 d 。計(jì)算篩選克隆總數(shù)：187 cfu/0.1 ml×100×15 ml=2.8 million。將陽性克隆在新鮮選擇培養(yǎng)平板上重新劃線以確認(rèn)陽性表型。并經(jīng)PCR分析以排除重復(fù)克隆。擴(kuò)增含有陽性克隆的酵母細(xì)胞后提取文庫質(zhì)粒DNA。將陽性文庫質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入Y1HGold[pAbAi/Bait]、Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]菌株。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物按照1︰100稀釋后，分別接種至以下平板：SD/-Leu、SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)。30 ℃孵育3～5 d，克隆生長情況如圖6：每種克隆、每株菌株在每種平板上各接種2個復(fù)點(diǎn)。C1、C3、C4、C6、C8轉(zhuǎn)化的Y1HGold[pAbAi/Bait]菌株在SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)平板上可以生長，而Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]菌株無法生長，證明為真正的陽性克?。籆2、C5、C7轉(zhuǎn)化的Y1HGold[pAbAi/Bait]菌株在SD/-Leu/AbA(300 ng/ml)平板上可以生長，Y1HGold[pAbAi/mu-Bait]菌株也可以生長，證明為假陽性克隆。

圖5 酵母單雜交cDNA文庫篩選陽性克隆

六、真性陽性克隆進(jìn)行測序分析結(jié)果

C1：Mus musculus serrate RNA effector molecule homolog (Arabidopsis)(Srrt), transcript variant 1, mRNA.

C3：Mus musculus heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B (Hnrnpab), transcript variant 2, mRNA.C4：Mus musculus interferon regulatory factor 1 (Irf1), transcript variant 1, mRNA.

C6：Mus musculus NK2 homeobox 5 (Nkx2.5), mRNA.

C8：Mus musculus zinc finger protein 953 (Zfp953), mRNA.

討 論

酵母單雜交方法(yeast one hybrid method) 是根據(jù)DNA 結(jié)合蛋白( 即轉(zhuǎn)錄因子) 與DNA 順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)道基因表達(dá)的原理來克隆編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的基因(cDNA)[4]。該方法也是在細(xì)胞內(nèi)(in vivo)分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的有效方法。在該系統(tǒng)中，目標(biāo)DNA和蛋白的作用發(fā)生在真核細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境，有利于保持蛋白的天然構(gòu)象，而且通過報(bào)告基因的表達(dá)水平變化來檢測雜交的發(fā)生，因而較其它的體外方法具有更高的準(zhǔn)確性[5]。

本研究利用Clontech公司酵母單雜交文庫構(gòu)建系統(tǒng)構(gòu)建了篩選Cltb啟動子順式元件結(jié)合蛋白的酵母單雜交文庫。該文庫的轉(zhuǎn)化效率為：187×50×100=9.35×105。對文庫的篩選最終獲得了5個含有完整ORF框的陽性克隆。其中，Srrt 和Zfp953同屬于鋅指蛋白家族，鋅指蛋白在真核生物中表達(dá)廣泛，具有廣泛的生物功能，如DNA識別，RNA包裝，轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，蛋白折疊和裝配，脂質(zhì)結(jié)合，并參與腫瘤的形成和機(jī)體免疫干預(yù)等功能[6-9]。

hnRNPs A/B屬于hnRNPs(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins)核內(nèi)不均一核糖核蛋白家族，是一組核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白，具有多種亞體，發(fā)揮一系列重要的細(xì)胞功能，如mRNA的剪接，mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控，核胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，RNA代謝轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，DNA復(fù)制與重組[10-12]。Irf1不僅可激活Ⅰ類干擾素基因的表達(dá)，還有抗腫瘤效應(yīng)及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[13-16]。NKx2.5是NK型同源盒基因家族Nkx2型的成員，是重要的轉(zhuǎn)錄因子，與心臟發(fā)育、功能維系密切相關(guān)。Nkx2.5的突變可以導(dǎo)致心肌肥厚、心律失常、先心病等疾病[17-19]。

由此可見，所構(gòu)建的酵母單雜交文庫符合要求，滿足實(shí)驗(yàn)需要。當(dāng)然，酵母單雜交作為一種研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的初步實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要進(jìn)一步加以證實(shí)。同時(shí)對以上5個基因在ALI/ARDS極性損傷中作用也正在研究中，以期獲得調(diào)控Cltb基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，并有助于進(jìn)一步闡明Cltb基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理。

1 金發(fā)光.急性肺損傷的診治研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2013, 6(1)：1-3.

2 Deborde S, Perret E, Gravotta D, et al. Clathrin is a key regulator of basolateral polarity[J]. Nature, 2008, 452 (7188): 719-723.

3 呂學(xué)軍, 陸衛(wèi)忠, 張永娟, 等. 酵母雙雜交篩選Clathrin相互作用蛋白[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2014, 7(4)：379-383.

4 Li JJ, Herskowitz I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system[J]. Science, 1993, 262(5141): 1870-1874.

5 Alle JB, Walberg MW, Edwards MC, et al. Finding prospective partners in the library: the two-hybrid system and phage display find a match[J]. Trends Biochem Sci, 1995, 20(12): 511-516.

6 Gruber JJ, Zatechka DS, Sabin LR, et al. Ars2 links the nuclear cap-binding complex to RNA interference and cell proliferation[J]. Cell, 2009, 138(2): 328-339.

7 Wilson MD, Wang D, Wagner R, et al. ARS2 is a conserved eukaryotic gene essential for early mammalian development[J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(5): 1503-1514.

8 Andreu-Agullo C, Maurin T, Thompson CB, et al. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2 [J]. Nature. 2011, 481(7380): 195-198.

9 Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV. Structural classification of zinc fingers: survey and summary[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(2): 532-550.

10 Taga Y, Miyoshi M, Okajima T, et al. Identification of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B as a cytoplasmic mRNA-binding protein in early involution of the mouse mammary gland[J]. Cell Biochem Funct. 2010, 28(4):321-328.

11 Sinnamon JR, Waddell CB, Nik S, et al. Hnrpab regulates neural development and neuron cell survival after glutamate stimulation [J]. RNA, 2012, 18(4):704-719.

12 Fukuda N, Fukuda T, Sinnamon J, et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis[J]. PLoS Genet, 2013, 9(10): e1003858.

13 Maloney NS, Thackray LB, Goel G, et al. Essential cell-autonomous role for interferon (IFN) regulatory factor 1 in IFN-γ-mediated inhibition of norovirus replication in macrophages[J]. J Virol, 2012, 86(23): 12655-12664.

14 Jiang DS, Li L, Huang L, et al. Interferon regulatory factor 1 is required for cardiac remodeling in response to pressure overload [J]. Hypertension, 2014, 64(1): 77-86.

15 Yoon GS, Dong C, Gao N, et al. Interferon regulatory factor-1 in flagellin-induced reprogramming: potential protective role of CXCL10 in cornea innate defense against Pseudomonas aeruginosa infection[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2013, 54(12): 7510-7521.

16 Zhang L, Cardinal JS, Pan P, et al. Splenocyte apoptosis and autophagy is mediated by interferon regulatory factor 1 during murine endotoxemia [J]. Shock, 2012, 37(5): 511-517.

17 Nakashima Y, Yanez DA, Touma M, et al. Nkx2-5 suppresses the proliferation of atrial myocytes and conduction system [J]. Circ Res. 2014, 114(7):1103-1113.

18 Zheng W, Lu YB, Liang ST, et al. SIRT1 mediates the protective function of Nkx2.5 during stress in cardiomyocytes[J]. Basic Res Cardiol, 2013, 108(4): 364.

19 Zhang L, Nomura-Kitabayashi A, Sultana N, et al. Mesodermal Nkx2.5 is necessary and sufficient for early second heart field development[J]. Dev Biol. 2014, 390(1): 68-79.

(本文編輯：王亞南)

呂學(xué)軍，陸衛(wèi)忠，張永娟，等. 篩選小鼠Cltb 啟動子順式元件結(jié)合蛋白的酵母單雜交文庫的構(gòu)建[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(1)： 24-29.

Construction of yeast one-hybrid library for screening the binding protein of mouse Cltb promoter cis-element

LyuXuejun1,LuWeizhong1,ZhangYongjuan2,GuoLiang1,LiShaoying1,LiYuying1,QianGuiSheng1(1InstituteofRespirationDiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;2DepartmentofPhysiology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China)

LiYuying,Email:lzhlyyhy@163.com

Objective To screen the binding protein of mouse Cltb promoter cis-element using the yeast one hybrid system. Methods Step 1, the bait plasmid pBait-AbAi of Cltb regulatory sequence was constructed and transformed into Y1HGold yeast to build stable expression strain of "bait-Report". Step 2, the yeast one-hybrid cDNA AD fusion expression library of mouse lung was constructed with SMARTTMtechnology to screen transcription factors of mouse Cltb. Results The yeast one hybrid library of screening Cltb promoter cis element binding protein was successfully constructed. The results showed that the co-transformation efficiency was 9.35×105CFU /μg. 5 positive clones were screened and sequenced, we got five encoding genes of binding protein：Srrt; hnRNPs A/B; Irf1; NKx2.5 and Zfp953.Conclusion The yeast one-hybrid library meets the requirement of laboratory, The above work laid a foundation for the screening of transcription factors regulating Cltb gene expression.

Clathrin; Yeast One-hybrid; transcriptional regulation

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.006

國家自然科學(xué)基金資助(81070052)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸病 研究所1523808 東莞，廣東醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室2

李玉英，Email: lzhlyyhy@163.com

R563

A

2014-07-19)