鴨疫里默桿菌mazp 基因克隆表達(dá)及免疫原性分析

王秀禎，羅永芳，夏文君，羅雪剛，彭少靜，周 念，李繼祥

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶402460）

鴨疫里默桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種不運(yùn)動、無芽胞的革蘭陰性菌，主要感染2周齡～8周齡鴨，病死鴨以纖維素性心包炎、肝周炎及氣囊炎為主要特征［1］。該菌是當(dāng)前危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病原菌之一，可使鵝、火雞、雞［2］等多種家禽及野鳥感染發(fā)病。RA 全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，有多種胞外蛋白酶基因且菌株間高度保守［3－5］。胞外蛋白酶作為病原性細(xì)菌的重要毒力因子，具有溶組織、抗吞噬和促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散等多種作用，是多種細(xì)菌的保 護(hù) 性 抗 原 之 一，且 不 具 有 血 清 型 特 異 性［6－8］。Pathanasophon P等［9］發(fā)現(xiàn)，RA 肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液（鋁膠佐劑）可以誘導(dǎo)小鴨獲得對攻毒的保護(hù)；我們在前期進(jìn)行比較基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，自然弱毒RA－DY9株［10］缺失胞外蛋白酶membrane－associated zinc metalloprotease（mazp）基因（資料未發(fā)表）。為探索RA 各血清型菌株共同的保護(hù)性抗原，本研究對鴨疫里默桿菌胞外蛋白酶基因mazp進(jìn)行原核表達(dá)，并通過動物試驗(yàn)測定表達(dá)蛋白的免疫原性。

1 材料與方法

1.1 材料

RA－AF 株（血 清2 型）、RA－BSY 株（血 清1型），試驗(yàn)感染鴨能引起典型的“三炎”［11］；RA－DY9株，對14 日齡鴨無毒力的自然弱毒株［10］。E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、pET－32a（＋）、RA－AF株細(xì)菌抗血清、RA－AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清由西南大學(xué)榮昌校區(qū)獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室保存；pMD19－T Vector、PCR 試 劑、DNA 膠 回 收 和DNA 連接試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；His－Bind樹脂為德國Merck公司產(chǎn)品；Western blot試劑盒為加拿大BioBasic公司產(chǎn)品。5 日齡、12日齡花邊鴨由重慶永健生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動物基地提供。

1.2 方法

1.2.1 mazp基因的克隆 參照GenBank 已發(fā)表的RA－GD 株mazp基因核苷酸序列（CP002562.1），利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1 對上、下游引物（P1：5′－GGATCCGATTTGTTAACCCAAAT－3′，P2：5′－AAAGCTTAATGTCACTTCCAATAATGAG－3′），在上、下游引物的5′端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 326bp左右，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

按照參考文獻(xiàn)［12］利用SDS／CTAB 法提取RA－AF 株細(xì)菌基因組DNA。以提取的基因組DNA 為模板擴(kuò)增目的基因片段。PCR 反應(yīng)體系（25.0μL）：基因組DNA 1.0μL，10×PCR buffer（Mg2＋free）2.5μL，dNTPs（各2.5 mmoL／L）2.0μL，MgCL2（25mmoL／L）2.0μL，上、下游引物（10μmoL／L）各2.0μL，TaKaRa r Taq（5 U／μL）0.25μL，加水至總體積為25.0μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃3 min；95 ℃1 min，49 ℃1 min，72 ℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。10g／L 的瓊脂糖凝膠電泳觀察，利用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，純化產(chǎn)物與pMD19－T 載體在經(jīng)16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，藍(lán)白斑篩選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)后寄上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI中利用Blast進(jìn)行比對分析。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 利用最小堿裂解法提取含mazp基因的重組質(zhì)粒和原核表達(dá)質(zhì) 粒pET－32a（＋），并 分 別 利 用HindⅢ 和BamHⅠ在30 ℃水浴中作用2h 進(jìn)行雙酶切；10g／L瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收mazp基因和線性化pET－32a（＋）并用T4DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；陽性重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），IPTG（1 mmol／L）誘導(dǎo)菌液用SDS－PAGE進(jìn)行重組蛋白的檢測。表達(dá)融合蛋白按說明書用His.Bind樹脂進(jìn)行純化及用RA－AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.3 mazp蛋白免疫小鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn) mazp蛋白經(jīng)純化后利用生理鹽水配置成0.6mg／mL，按1∶2（V／V）與礦物油佐劑（柏油、司班、硬脂酸鋁）乳化為油包水的免疫抗原。88只5日齡鴨隨機(jī)分成8組，每組11只；第1組、第2組每只鴨頸部皮下接種免疫抗原0.5 mL（免疫原蛋白含量0.2 mg／mL），第3組、第4組每只免疫油包水RA－AF株全菌抗原0.5mL（免疫原細(xì)菌含量1.0×1010cfu／mL），第5組、第6組每只免疫油包水pET－32a（＋）標(biāo)簽蛋白（免疫原蛋白含量0.2mg／mL），第7組、第8組為空白對照組；免疫后15d，第1組、第3組、第5組、第7組小鴨用RA－AF 株菌懸液經(jīng)腿部皮下接種0.2mL／只（100LD50），第2組、第4組、第6組、第8組接種RA－BSY 株0.2mL／只（100LD50）；攻毒后連續(xù)觀察10d，記錄發(fā)病及死亡情況。

1.2.4 mazp蛋白抗血清的被動免疫保護(hù)試驗(yàn) 用1.2.3制備的mazp蛋白和標(biāo)簽蛋白免疫抗原分別免疫健康家兔制備抗血清，免疫程序?yàn)椋旱?次背部皮下多點(diǎn)注射1.5mL／只，每間隔14d進(jìn)行一次加強(qiáng) 免 疫，第2 次 免 疫2.0 mL／只，第3 次 免 疫3.0mL／只。第3次免疫后14d采血分離血清用于被動免疫保護(hù)試驗(yàn)。88只12日齡鴨隨機(jī)分成8組，每組11 只；第1 組、第2 組每只鴨頸部皮下注射mazp蛋白抗血清2.0mL，第3、4組注射RA－AF株細(xì)菌抗血清2.0mL，第5、6組注射標(biāo)簽蛋白抗血清2.0mL，第7、8組注射生理鹽水作對照組。注射血清后24h，第1 組、第3 組、第5 組、第7 組用RAAF 株菌懸液經(jīng)腿部皮下接種0.2mL／只（100LD50），第2、第4、第6、第8組接種RA－BSY 株0.2mL／只（100LD50）；攻毒后連續(xù)觀察10d，記錄發(fā)病及死亡情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 按Sandhu的方法［13］計(jì)算保護(hù)指數(shù)（PI），并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默桿菌mazp基因的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，以RA－AF株細(xì)菌基因組DNA 為模板擴(kuò)增獲得一條介于1 000bp～2 500bp的DNA 條帶（圖1）。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆、測序得到1 326bp的核苷酸序列。該序列在核苷酸和氨基酸水平與 RA－ATCC 11845（CP003388.1）和RA－GD（CP002562.1）株mazp 基因的相似性均在99%以上。

圖1 RA－AF株細(xì)菌mazp基因的PCR 結(jié)果Fig.1 PCR result of mazp gene of RA－AF strain

2.2 mazp基因的原核表達(dá)

利用pET－32a（＋）構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET－32a－mazp 轉(zhuǎn) 入E.coli BL21（DE3），并 經(jīng)IPTG（1mmoL／mL）在37℃誘導(dǎo)5h，表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)尿素變性，利用His.Bind樹脂純化獲得mazp 蛋白（圖2）。Western blot結(jié)果顯示，mazp蛋白能與RA－AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖3）。

圖2 SDS－PAGE檢測重組蛋白Fig.2 Detection of recombinant protein by SDS－PAGE

圖3 重組蛋白Western blot檢測Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein

2.3 攻毒保護(hù)

試驗(yàn)鴨經(jīng)免疫抗原免疫15d后的攻毒保護(hù)結(jié)果見表1。mazp 蛋白抗原免疫動物經(jīng)RA－AF 株（血清2型）細(xì)菌攻毒的死亡率和保護(hù)指數(shù)分別為27.3%和62.4，RA－BSY 株（血清1型）攻毒的死亡率和保護(hù)指數(shù)分別為18.2%和77.8，二者死亡率間的差異不顯著（X2＝0.009）。

表1 主動免疫鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn)Table 1 Protection of ducks by active immunization against challenge with RA

在抗血清的被動免疫保護(hù)試驗(yàn)中，注射mazp蛋白抗血清動物在RA－AF和RA－BSY 株細(xì)菌攻毒后第5天開始發(fā)病，第7天開始死亡，注射標(biāo)簽蛋白抗血清和空白對照在攻毒后第2天開始發(fā)病及第3天開始死亡。mazp蛋白抗血清對RA－AF和RA－BSY的攻毒保護(hù)指數(shù)分別為45.5和27.3，二者間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

表2 被動免疫鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn)Table 2 Protection of ducks by passive immunization against challenge with RA

3 討論

RA 感染對我國養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重，在使用化學(xué)藥物的情況下，許多養(yǎng)鴨場的發(fā)病率仍超過50%、病死率在80%以上。疫苗免疫預(yù)防已被證實(shí)在RA感染防控中是有效的，但現(xiàn)有菌體疫苗具有型特異性，在生產(chǎn)中廣泛使用受到限制［14］。因此，不具有型特異性的保護(hù)性抗原是今后RA 疫苗研究需要重點(diǎn)解決的問題。隨著RA－GD［3］、RA－MY［4］和RAATCC11845［5］等全基因組序列的測定及各基因的功能注釋，為研究不同血清型菌株共同保護(hù)性抗原提供了新的思路。本文在前期研究發(fā)現(xiàn)自然弱毒RA－DY9株缺失胞外蛋白酶基因mazp的基礎(chǔ)上研究原核表達(dá)mazp蛋白的免疫原性，是探索RA 各血清菌株共同保護(hù)性抗原的一次有益嘗試。

mazp蛋白是一種不具有型特異性的保護(hù)性抗原，但不具有完全免疫保護(hù)作用。RA－AF肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液中除有部分在培養(yǎng)過程中死亡溶解菌體結(jié)構(gòu)成分外，主要是細(xì)菌在生長繁殖過程中分泌的可溶性成分，胞外蛋白酶就是其中之一。由于沒有純化RA 胞外蛋白酶mazp及制備抗血清，本文用肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液抗血清替代進(jìn)行Western blot。Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)mazp蛋白具有反應(yīng)原性。在主動免疫保護(hù)試驗(yàn)中，mazp蛋白免疫鴨獲得攻毒保護(hù)指數(shù)（PI）在60以上，無血清型間的差異；在被動免疫保護(hù)試驗(yàn)中，mazp蛋白抗血清能延緩攻毒動物的發(fā)病和死亡時(shí)間、降低發(fā)病率和死亡率。胞外蛋白酶為病原性細(xì)菌合成并分泌到細(xì)胞外的非結(jié)構(gòu)成分，其抗體僅能通過影響蛋白酶自身來實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)菌擴(kuò)散和對組織的損傷等，對菌體無影響，這是mazp蛋白抗原在動物試驗(yàn)中不具有完全保護(hù)作用的原因。在今后RA 疫苗研究工作中，應(yīng)將mazp蛋白與其他結(jié)構(gòu)成分聯(lián)合使用以提高免疫保護(hù)率。

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