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      鴨疫里默桿菌mazp 基因克隆表達(dá)及免疫原性分析

      2015-06-11 02:21:28王秀禎羅永芳夏文君羅雪剛彭少靜李繼祥
      動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2015年2期
      關(guān)鍵詞:鴨疫胞外濾液

      王秀禎,羅永芳,夏文君,羅雪剛,彭少靜,周 念,李繼祥

      (西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系,重慶402460)

      鴨疫里默桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一種不運(yùn)動、無芽胞的革蘭陰性菌,主要感染2周齡~8周齡鴨,病死鴨以纖維素性心包炎、肝周炎及氣囊炎為主要特征[1]。該菌是當(dāng)前危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病原菌之一,可使鵝、火雞、雞[2]等多種家禽及野鳥感染發(fā)病。RA 全基因組序列分析發(fā)現(xiàn),有多種胞外蛋白酶基因且菌株間高度保守[3-5]。胞外蛋白酶作為病原性細(xì)菌的重要毒力因子,具有溶組織、抗吞噬和促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散等多種作用,是多種細(xì)菌的保 護(hù) 性 抗 原 之 一,且 不 具 有 血 清 型 特 異 性[6-8]。Pathanasophon P等[9]發(fā)現(xiàn),RA 肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液(鋁膠佐劑)可以誘導(dǎo)小鴨獲得對攻毒的保護(hù);我們在前期進(jìn)行比較基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),自然弱毒RA-DY9株[10]缺失胞外蛋白酶membrane-associated zinc metalloprotease(mazp)基因(資料未發(fā)表)。為探索RA 各血清型菌株共同的保護(hù)性抗原,本研究對鴨疫里默桿菌胞外蛋白酶基因mazp進(jìn)行原核表達(dá),并通過動物試驗(yàn)測定表達(dá)蛋白的免疫原性。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      RA-AF 株(血 清2 型)、RA-BSY 株(血 清1型),試驗(yàn)感染鴨能引起典型的“三炎”[11];RA-DY9株,對14 日齡鴨無毒力的自然弱毒株[10]。E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、pET-32a(+)、RA-AF株細(xì)菌抗血清、RA-AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清由西南大學(xué)榮昌校區(qū)獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室保存;pMD19-T Vector、PCR 試 劑、DNA 膠 回 收 和DNA 連接試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;His-Bind樹脂為德國Merck公司產(chǎn)品;Western blot試劑盒為加拿大BioBasic公司產(chǎn)品。5 日齡、12日齡花邊鴨由重慶永健生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動物基地提供。

      1.2 方法

      1.2.1 mazp基因的克隆 參照GenBank 已發(fā)表的RA-GD 株mazp基因核苷酸序列(CP002562.1),利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1 對上、下游引物(P1:5′-GGATCCGATTTGTTAACCCAAAT-3′,P2:5′-AAAGCTTAATGTCACTTCCAATAATGAG-3′),在上、下游引物的5′端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 326bp左右,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

      按照參考文獻(xiàn)[12]利用SDS/CTAB 法提取RA-AF 株細(xì)菌基因組DNA。以提取的基因組DNA 為模板擴(kuò)增目的基因片段。PCR 反應(yīng)體系(25.0μL):基因組DNA 1.0μL,10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μL,dNTPs(各2.5 mmoL/L)2.0μL,MgCL2(25mmoL/L)2.0μL,上、下游引物(10μmoL/L)各2.0μL,TaKaRa r Taq(5 U/μL)0.25μL,加水至總體積為25.0μL。PCR 擴(kuò)增程序:95 ℃3 min;95 ℃1 min,49 ℃1 min,72 ℃1.5min,30個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。10g/L 的瓊脂糖凝膠電泳觀察,利用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物,純化產(chǎn)物與pMD19-T 載體在經(jīng)16 ℃過夜連接,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α,藍(lán)白斑篩選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)后寄上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI中利用Blast進(jìn)行比對分析。

      1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 利用最小堿裂解法提取含mazp基因的重組質(zhì)粒和原核表達(dá)質(zhì) 粒pET-32a(+),并 分 別 利 用HindⅢ 和BamHⅠ在30 ℃水浴中作用2h 進(jìn)行雙酶切;10g/L瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收mazp基因和線性化pET-32a(+)并用T4DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞;陽性重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)菌液用SDS-PAGE進(jìn)行重組蛋白的檢測。表達(dá)融合蛋白按說明書用His.Bind樹脂進(jìn)行純化及用RA-AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清進(jìn)行Western blot檢測。

      1.2.3 mazp蛋白免疫小鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn) mazp蛋白經(jīng)純化后利用生理鹽水配置成0.6mg/mL,按1∶2(V/V)與礦物油佐劑(柏油、司班、硬脂酸鋁)乳化為油包水的免疫抗原。88只5日齡鴨隨機(jī)分成8組,每組11只;第1組、第2組每只鴨頸部皮下接種免疫抗原0.5 mL(免疫原蛋白含量0.2 mg/mL),第3組、第4組每只免疫油包水RA-AF株全菌抗原0.5mL(免疫原細(xì)菌含量1.0×1010cfu/mL),第5組、第6組每只免疫油包水pET-32a(+)標(biāo)簽蛋白(免疫原蛋白含量0.2mg/mL),第7組、第8組為空白對照組;免疫后15d,第1組、第3組、第5組、第7組小鴨用RA-AF 株菌懸液經(jīng)腿部皮下接種0.2mL/只(100LD50),第2組、第4組、第6組、第8組接種RA-BSY 株0.2mL/只(100LD50);攻毒后連續(xù)觀察10d,記錄發(fā)病及死亡情況。

      1.2.4 mazp蛋白抗血清的被動免疫保護(hù)試驗(yàn) 用1.2.3制備的mazp蛋白和標(biāo)簽蛋白免疫抗原分別免疫健康家兔制備抗血清,免疫程序?yàn)椋旱?次背部皮下多點(diǎn)注射1.5mL/只,每間隔14d進(jìn)行一次加強(qiáng) 免 疫,第2 次 免 疫2.0 mL/只,第3 次 免 疫3.0mL/只。第3次免疫后14d采血分離血清用于被動免疫保護(hù)試驗(yàn)。88只12日齡鴨隨機(jī)分成8組,每組11 只;第1 組、第2 組每只鴨頸部皮下注射mazp蛋白抗血清2.0mL,第3、4組注射RA-AF株細(xì)菌抗血清2.0mL,第5、6組注射標(biāo)簽蛋白抗血清2.0mL,第7、8組注射生理鹽水作對照組。注射血清后24h,第1 組、第3 組、第5 組、第7 組用RAAF 株菌懸液經(jīng)腿部皮下接種0.2mL/只(100LD50),第2、第4、第6、第8組接種RA-BSY 株0.2mL/只(100LD50);攻毒后連續(xù)觀察10d,記錄發(fā)病及死亡情況。

      1.2.5 數(shù)據(jù)處理 按Sandhu的方法[13]計(jì)算保護(hù)指數(shù)(PI),并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

      2 結(jié)果

      2.1 鴨疫里默桿菌mazp基因的擴(kuò)增

      瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,以RA-AF株細(xì)菌基因組DNA 為模板擴(kuò)增獲得一條介于1 000bp~2 500bp的DNA 條帶(圖1)。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆、測序得到1 326bp的核苷酸序列。該序列在核苷酸和氨基酸水平與 RA-ATCC 11845(CP003388.1)和RA-GD(CP002562.1)株mazp 基因的相似性均在99%以上。

      圖1 RA-AF株細(xì)菌mazp基因的PCR 結(jié)果Fig.1 PCR result of mazp gene of RA-AF strain

      2.2 mazp基因的原核表達(dá)

      利用pET-32a(+)構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-32a-mazp 轉(zhuǎn) 入E.coli BL21(DE3),并 經(jīng)IPTG(1mmoL/mL)在37℃誘導(dǎo)5h,表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)尿素變性,利用His.Bind樹脂純化獲得mazp 蛋白(圖2)。Western blot結(jié)果顯示,mazp蛋白能與RA-AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。

      圖2 SDS-PAGE檢測重組蛋白Fig.2 Detection of recombinant protein by SDS-PAGE

      圖3 重組蛋白Western blot檢測Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein

      2.3 攻毒保護(hù)

      試驗(yàn)鴨經(jīng)免疫抗原免疫15d后的攻毒保護(hù)結(jié)果見表1。mazp 蛋白抗原免疫動物經(jīng)RA-AF 株(血清2型)細(xì)菌攻毒的死亡率和保護(hù)指數(shù)分別為27.3%和62.4,RA-BSY 株(血清1型)攻毒的死亡率和保護(hù)指數(shù)分別為18.2%和77.8,二者死亡率間的差異不顯著(X2=0.009)。

      表1 主動免疫鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn)Table 1 Protection of ducks by active immunization against challenge with RA

      在抗血清的被動免疫保護(hù)試驗(yàn)中,注射mazp蛋白抗血清動物在RA-AF和RA-BSY 株細(xì)菌攻毒后第5天開始發(fā)病,第7天開始死亡,注射標(biāo)簽蛋白抗血清和空白對照在攻毒后第2天開始發(fā)病及第3天開始死亡。mazp蛋白抗血清對RA-AF和RA-BSY的攻毒保護(hù)指數(shù)分別為45.5和27.3,二者間差異不顯著(P>0.05)(表2)。

      表2 被動免疫鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn)Table 2 Protection of ducks by passive immunization against challenge with RA

      3 討論

      RA 感染對我國養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重,在使用化學(xué)藥物的情況下,許多養(yǎng)鴨場的發(fā)病率仍超過50%、病死率在80%以上。疫苗免疫預(yù)防已被證實(shí)在RA感染防控中是有效的,但現(xiàn)有菌體疫苗具有型特異性,在生產(chǎn)中廣泛使用受到限制[14]。因此,不具有型特異性的保護(hù)性抗原是今后RA 疫苗研究需要重點(diǎn)解決的問題。隨著RA-GD[3]、RA-MY[4]和RAATCC11845[5]等全基因組序列的測定及各基因的功能注釋,為研究不同血清型菌株共同保護(hù)性抗原提供了新的思路。本文在前期研究發(fā)現(xiàn)自然弱毒RA-DY9株缺失胞外蛋白酶基因mazp的基礎(chǔ)上研究原核表達(dá)mazp蛋白的免疫原性,是探索RA 各血清菌株共同保護(hù)性抗原的一次有益嘗試。

      mazp蛋白是一種不具有型特異性的保護(hù)性抗原,但不具有完全免疫保護(hù)作用。RA-AF肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液中除有部分在培養(yǎng)過程中死亡溶解菌體結(jié)構(gòu)成分外,主要是細(xì)菌在生長繁殖過程中分泌的可溶性成分,胞外蛋白酶就是其中之一。由于沒有純化RA 胞外蛋白酶mazp及制備抗血清,本文用肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液抗血清替代進(jìn)行Western blot。Western blot結(jié)果顯示,表達(dá)mazp蛋白具有反應(yīng)原性。在主動免疫保護(hù)試驗(yàn)中,mazp蛋白免疫鴨獲得攻毒保護(hù)指數(shù)(PI)在60以上,無血清型間的差異;在被動免疫保護(hù)試驗(yàn)中,mazp蛋白抗血清能延緩攻毒動物的發(fā)病和死亡時(shí)間、降低發(fā)病率和死亡率。胞外蛋白酶為病原性細(xì)菌合成并分泌到細(xì)胞外的非結(jié)構(gòu)成分,其抗體僅能通過影響蛋白酶自身來實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)菌擴(kuò)散和對組織的損傷等,對菌體無影響,這是mazp蛋白抗原在動物試驗(yàn)中不具有完全保護(hù)作用的原因。在今后RA 疫苗研究工作中,應(yīng)將mazp蛋白與其他結(jié)構(gòu)成分聯(lián)合使用以提高免疫保護(hù)率。

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