牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA 方法的建立

范 晴，謝芝勛，謝志勤，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝麗基，羅思思

（廣西獸醫(yī)研究所廣西動物疫苗和新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一種牛的呼吸道及繁殖障礙綜合征［1］。該病可通過血液、鼻黏液、糞便等多種途徑水平傳播［2］。據(jù)調(diào)查該病在我國大部份地區(qū)廣泛存在，病感染率高，牛群中相當(dāng)一部分是BVDV 的攜帶者，雖然它們不表現(xiàn)臨床癥狀，但終身帶毒，持續(xù)排毒；該病還可以病垂直傳播，當(dāng)孕期的母牛感染BVDV，會引起死產(chǎn)，胚胎畸形，流產(chǎn)，或者分娩出外表正常的但持續(xù)感染的犢牛，當(dāng)這些持續(xù)感染的犢牛再次接觸抗原相似性BVDV 即會轉(zhuǎn)變?yōu)轲つげ?，出現(xiàn)急性脫水性腹瀉，1月～2月內(nèi)死亡，死亡率高達(dá)100%［3］。這些持續(xù)感染BVDV牛的是養(yǎng)牛業(yè)潛在的隱患，一旦發(fā)病會成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。

目前對該病的防控主要依靠疫苗免疫接種，并利用特異性診斷方法檢測出持續(xù)感染牛，淘汰持續(xù)感染牛遂步凈化牛群［5－6］。由于BVDV 可引起免疫抑制，即使感染BVDV 也不會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此BVDV 的確診需檢測其抗原，常見的抗原檢測方法有PCR、LAMP和ELISA［7－9］。但PCR 和LAMP有一定的局限性，需不斷更新引物才能適應(yīng)BVDV的變異（目前已知的BVDV 有15個基因）。ELISA方法操作簡單，快速，一次可檢測數(shù)百份樣品，非常適合大規(guī)格疫情的檢測。由于BVDV 僅有一種血清型，更適合于用ELSIA 進(jìn)行檢測。本研究利用NS3單克隆抗體為捕獲抗原，建立BVDV 抗原捕獲ELISA 方法，為今后BVDV 的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BVDV 毒 株Oregon CV24，NADL 株，BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清等均購自中國獸藥監(jiān)察所；牛腎細(xì)胞MDBK 為中國細(xì)胞典藏中心產(chǎn)品；抗BVDV NS3蛋白單克隆抗體，2個廣西分離株GX－4，GX－6136由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離；牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV），牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV），牛分支桿菌（Mycobacterium bovis，MB），豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；50 份陰性樣品（經(jīng)國標(biāo)［10］檢測后，結(jié)果為陰性的樣品），45份待檢臨床牛糞便棉拭子樣品采集自廣西各地牛場；HRP－羊抗鼠IgG 為索萊寶公司產(chǎn)品；TMB 底物顯色劑為天根公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖 MDBK 細(xì)胞培養(yǎng)至單層，參考文獻(xiàn)繁殖CV24毒株［11］。CV24接毒96h后，細(xì)胞出現(xiàn)典型病變，收獲細(xì)胞復(fù)凍融3 次，10kg 離心10min，收集上清，用差速離心及不連續(xù)蔗糖密度梯度離心純化病毒，按照ReeD－Muench 計算TCID50為10－6.9／0.1 mL，將純化后的病毒無菌分裝后置－70 ℃保存。

1.2.2 兔多克隆抗體的制備與純化 純化后的CV24細(xì)胞培養(yǎng)液無菌取出后與弗氏完全佐劑按1∶1的均勻混合，分3次免疫1月齡母兔，每次間隔10d，背部肢肌肉分點(diǎn)注射抗原2 mL／只，三免后，間隔1周心臟采血并分離血清，采用辛酸－硫酸銨法純化血清，置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗原捕獲ELISA 方法的建立

1.2.3.1 包被抗體的確定 用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液分別包被1.2.2制備好的兔抗BVDV 多抗和BVDV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，100μL／孔，37 ℃1h轉(zhuǎn)4 ℃過夜，包被的濃度依次是1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800，試驗(yàn)重復(fù)3次，比較兩種多抗作為捕獲抗體的效果，其余步驟均按ELISA 標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行操作，并設(shè)立陰性對照。

1.2.3.2 單抗使用濃度的確定 用10g／L BSA（牛血清白蛋白）作稀釋劑，BVDV NS3單克隆抗體作為捕獲抗體，每列按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000稀釋，設(shè)立陰性對照，采用方陣滴定法進(jìn)行測定，重復(fù)試驗(yàn)3次，檢測OD450nm 值，選擇P／N值最大的一組為最佳捕獲抗體濃度［10］。

1.2.3.3 酶標(biāo)抗體使用濃度的確定 HRP－羊抗鼠IgG 按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 稀釋進(jìn)行ELSIA，重復(fù)試驗(yàn)3 次，檢測OD450nm值，選擇P／N 值最大的一組為最佳捕獲抗體濃度。

1.2.3.4 陰陽性臨界值的確定 用已建立的抗原捕獲ELISA 檢測50 份陰性臨床樣品，取其OD450nm的平均值ˉx，進(jìn)行樣本OD450nm 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的計算。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則，若樣品的OD450nm 值＞陰性樣本OD450nm 值的ˉx＋3SD 時，可以在99.9%水平上判為陽性，當(dāng)測結(jié)果仍大于臨界值，則判定為陽性。

1.2.3.5 特異性試驗(yàn) 將對照病毒（BRV、IBRV、HCV）和細(xì)菌（MB）用培養(yǎng)物作待檢樣品，100μL／孔，用上述建立的ELISA 方法檢測測定其OD450nm值，以評價該方法的特異性。

1.2.3.6 敏 感 性 試 驗(yàn) 將TCID50為10－6.9／0.1mL的CV24的細(xì)胞培養(yǎng)液從1∶10開始系列稀釋，各個稀釋度的病毒液100μL 用進(jìn)行ELISA 測定，確定該方法對病毒的最低檢出量。

1.2.3.7 臨床樣品的檢測 參照國標(biāo)合成引物，并進(jìn)行RT－PCR 檢測［10］。45份臨床牛糞便棉拭子樣品采集自廣西各地牛場，用DMEM 培養(yǎng)基洗脫棉拭子，5 000r／min離心10min后取上清作為待檢樣品，用建立的抗原捕獲ELISA 和RT－PCR 方法檢測，同時檢測檢測NADL 株，2 個廣西分離株GX－4，GX－6136。

2 結(jié)果

2.1 抗原捕獲ELISA 方法的確定

根據(jù)間接ELISA 方陣試驗(yàn)結(jié)果，最佳的包被抗體為兔抗BVDV 多抗，濃度為1∶1 600，最佳捕獲抗體濃度為1∶2 000。當(dāng)包被抗體量為1∶1 600／孔，捕獲抗體濃度為1∶2 000 時，陽性樣品OD450nm 與陰性對照OD450nm 的比值（P／N）最高，酶標(biāo)抗體最佳工作濃度為1∶4 000（表1，圖1）。

圖1 酶標(biāo)抗體工作濃度的確定Fig.1 Determination of optimum working concentration of antibody labeled with enzyme

表1 最佳抗體包被濃度和捕獲抗體濃度的確定Table 1 Determination of optimum working concentration of coating antibody and capture antibody

操作步驟確定后如下：兔抗BVDV 多抗1∶1 600包被，100μL／孔，37 ℃作用1h 后，4 ℃過夜；PBST 洗板3次；50g／L 脫脂奶封閉60min，PBST洗板3次；加待檢樣品（臨床樣品）100μL／孔，作用60min；PBST 洗板3次；加捕獲抗體（NS3單抗1∶2 000稀釋），100μL／孔，作用1h 后；HRP－羊抗鼠IgG 1∶4 000稀釋作用60min；PBST 洗板3次；顯色；最后2 mol／L 的硫酸終止反應(yīng)，置酶標(biāo)儀讀取OD450nm 的值。

2.2 陰陽性臨界值的確定

取50份陰性牛血清，用所建立的ELISA 進(jìn)行檢測，OD450nm 的平均值為0.327 和標(biāo)準(zhǔn)差為0.089確定其臨界值為0.327＋0.89×3＝0.594，定義E2－ELISA 檢測樣品OD450nm≥0.319為陽性，OD450nm＜0.594為陰性。

2.3 特異性試驗(yàn)

建立的ELISA 方法檢測BRV、IBRV、MD、HCV 測定OD450nm 值，均低于0.594，視為陰性，可見該方法特異性好，結(jié)果見表2。

表2 抗原捕獲ELISA 方法特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The specificity test result of Ag－capture ELISA

2.4 敏感性試驗(yàn)

將CV24細(xì)胞培養(yǎng)液（10－6.9／0.1mL）從1∶10開始系列稀釋進(jìn)行ELISA 測定。結(jié)果表明，細(xì)胞病毒液最低檢出量為7.9×103TCID50（表3）。

表3 抗原捕獲ELISA 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The sensitivity test result of Ag－capture ELISA

2.5 與RT－PCR方法比較結(jié)果

用建立的抗原捕獲ELISA 和RT－PCR 方法檢測BVDV NADL 株，2 個 廣 西 分 離 株GX－4，GX－6136，以及本實(shí)驗(yàn)室所保存45份臨床牛糞便棉拭子（其中18份為陽性樣品，27份為陰性樣品），符合率為100%，結(jié)果見表4（陰性樣品結(jié)果省略）。

表4 RT－PCR與抗原捕獲ELISA 方法的比較Table 4 The comparing result of RT－PCR and Ag－capture ELISA

3 討論

BVDV 感染機(jī)體后免疫系統(tǒng)的CD4＋T 細(xì)胞主要識別NS3和E2兩種蛋白，并可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生針這兩種蛋白的抗體［12］。但囊膜蛋白E2在各個毒株中變異較大，存在兩個可變區(qū)（V1、V2）［13－14］。NS3核苷酸序列分析表明，NS3 編碼區(qū)不僅在BVDV 各毒株間都較保守，且在不同基因型（BVDV1和BVDV2）和生物型（細(xì)胞病變型和非細(xì)胞病變型），以及瘟病毒屬中都是是非常保守的［12］。因此，本研究選擇BVDV NS3的單克隆抗體作為捕獲抗體。

本研究比較了BVDV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和兔抗BVDV 多抗2種抗體作為包被抗的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兔抗BVDV 多抗效果較好，P／N 值高，特異性好。推測BVDV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中存在抗牛的某些抗體，會BVDV 抗原發(fā)生非特異性結(jié)合；另外本試驗(yàn)是采用蔗糖密度梯度離心純化后的病毒免疫家兔，產(chǎn)生的抗體經(jīng)過純化后，純度較好，因此特異性好。

據(jù)報道BVDV 在我國廣泛在，安徽、江蘇、廣西各 省BVDV 感 染 率 為 分 別 為34.2%、8.4%、10%［3］。2009年－2012 年，廣西地區(qū)的BVDV 感染率高達(dá)24.8%（間接ELISA 方法檢出）和27.3%（熒 光 定 量RT－PCR 檢 測 出）［9］。通 常 情 況 下，BVDV 是以持續(xù)性感染不發(fā)病的形式存在于牛身體內(nèi)以，且BVDV 可引起免疫耐受，即使感染BVDV也不會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。由前面感染的數(shù)據(jù)可見，BVDV 抗體檢測率低于抗原檢出率。鑒于BVDV發(fā)病機(jī)理及臨床特征的復(fù)雜性，需要對其抗原的檢測才能準(zhǔn)確診斷牛是否感染了BVDV。本研究所建立的BVDV 抗原捕獲ELSIA 方法一次可以檢測數(shù)百個樣品，特異性好，敏感性高，最低可以檢測到7.9×103TCID50，操作方便，所需設(shè)備簡單，數(shù)小時內(nèi)可完成，可合適于大規(guī)模的檢測。對牛場進(jìn)行定期監(jiān)測，獲知全群感染水平，可初步確定BVDV 陽性感染場。在此基礎(chǔ)上，再結(jié)合其他診斷方法，才能逐步開展BVDV 的凈化，今后BVDV 的防制提供技術(shù)保障。

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