產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素單克隆抗體的研制

劉萌萌，樊 金，劉雪慧，秦貴平，張慧蓉，柴同杰

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技與動物醫(yī)學院，山東泰安271000）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）又名魏氏梭菌，是革蘭陽性產(chǎn)芽胞桿菌［1］，在自然界分布廣泛，可見于土壤、污水、飼料、食物、糞便以及人畜腸道中，是重要的人獸共患傳染病病原［2］。本菌能產(chǎn)生多種外毒素，根據(jù)其主要致病外毒素α、β、ε及ι［3］可分為A、B、C、D、E 5種菌型［4］。產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素是由產(chǎn)氣莢膜梭菌B 型和C 型菌株產(chǎn)生的壞死、致死性毒素，具有強烈的細胞毒性、致死性和神經(jīng)毒性［5］，可 引 起 人 和 動 物 壞 死 性 腸 炎［6－7］，具體表現(xiàn)為腸黏膜有出血性壞死，腸壁變薄，容易引起穿孔和破裂［8－10］，還能誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)反應，對人體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴重影響。此類病發(fā)病急、病死率高，給各國畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失［11－13］。因此，有效的檢測出毒素類型并進行針對性的治療極其重要。單克隆抗體具有質(zhì)地均一、純度高、特異性強、效價高等優(yōu)點，故其可作為標準試劑用于疾病的診斷，同時也可用于疾病的治療［14－15］。本試驗擬建立分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株，并鑒定其部分特性，為建立快速有效的臨床檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及其他材料 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC3180）由德國柏林大學提供，山東農(nóng)業(yè)大學環(huán)境微生物實驗室保存。6周齡～8周齡Balb／c雌性小鼠購于山東大學實驗動物中心。pET－28a載體、重組大腸埃希菌BL21（DE3）－β、純化的重組β毒素蛋白、天然粗提β毒素、骨髓瘤SP2／0 細胞等均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 High Affinity Ni－changed Resin購于南京金斯瑞生物科技有限公司；羊抗鼠IgGHRP 購自南京生興生物技術有限公司；RPMI－1640、HAT 選擇培養(yǎng)基、NCTC生長因子、HT 培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司；融合劑PEG1500購自德國Roche公司；卡那霉素、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑、單克隆抗體亞型鑒定試劑盒均購自美國Sigma公司；豆粉瓊脂購自北京九州天瑞科技有限公司；ELISA Kit（Clostridium perfringens）購自Bio－X 公司；其他所用化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 Balb／c小鼠的免疫 免疫方案：一免用山東農(nóng)業(yè)大學環(huán)境微生物實驗室制備的重組β毒素與等體積弗氏完全佐劑乳化后，腹腔注射100μg／只；二免、三免分別于首免后2周和5周將重組β毒素蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后，腹腔注射100μg／只；三免后3周腹腔注射不加佐劑的重組β毒素蛋白50μg／只～100μg／只。用間接ELISA 方法檢測免疫小鼠血清的抗體效價，選取免疫效價檢測值最高的小鼠的脾臟用于細胞融合。

1.2.2 雜交瘤細胞株的建立

1.2.2.1 骨髓瘤細胞（SP2／0）和脾細胞的準備于融合前兩周復蘇SP2／0，置于體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過程在培養(yǎng)液中加入8－氮鳥嘌吟，連續(xù)處理3次，使SP2／0細胞對HAT 培養(yǎng)液更加敏感。融合前1天傳代1次，使融合當天的骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期。取免疫效價檢測值最高的小鼠，無菌摘取脾臟，收集脾細胞懸液，脾細胞計數(shù)后備用。

1.2.2.2 飼養(yǎng)細胞的準備 細胞融合當天，取8周齡～10周齡健康Balb／c小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個／mL～5×105個／mL，按100μL／孔轉入到96孔細胞培養(yǎng)板中。

1.2.2.3 細胞的融合 將SP2／0細胞和免疫脾細胞懸液混勻，使用PEG1500進行化學法融合細胞，然后轉入96孔細胞培養(yǎng)板中，置體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2.4 雜交瘤細胞的篩選 融合后注意觀察雜交瘤細胞生長狀況，待細胞長到孔底的1／4～1／3時吸出上清進行間接ELISA 檢測。以P／N≥2.5作為陽性判斷標準，用未免疫小鼠血清作陰性對照，用抗體稀釋液做空白對照。對檢測為陽性的細胞進行擴大培養(yǎng)，同時進行克隆化培養(yǎng)。

1.2.2.5 雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng) 克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法，待細胞長到孔底的1／4～1／3時，對細胞上清進行間接ELISA 檢測。選擇克隆數(shù)少、OD450nm 值高的陽性孔，將其再次克隆。經(jīng)3 次～4次克隆操作，至所有克隆化細胞孔檢測陽性率達100%時，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細胞株，及時擴大培養(yǎng)并凍存。

1.2.2.6 雜交瘤細胞的擴大培養(yǎng)及凍存 單克隆細胞株經(jīng)過幾次克隆后，陽性率達到100%。將細胞從96孔培養(yǎng)板轉入24孔培養(yǎng)板中，再由24孔板轉入細胞培養(yǎng)瓶進行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)后，部分進行小鼠的腹腔注射，體內(nèi)生產(chǎn)腹水。另一部分可采用液氮凍存。

1.2.2.7 雜交瘤細胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性測定 將陽性雜交瘤細胞株連續(xù)培養(yǎng)兩個月后，用已經(jīng)建立的間接ELISA 方法檢測細胞培養(yǎng)上清的抗體效價。

1.2.3 單克隆抗體亞類鑒定 細胞培養(yǎng)上清中的單克隆抗體亞類通過試劑盒進行鑒定，按照試劑盒說明操作。

1.2.4 單克隆抗體腹水制備 取狀態(tài)良好的6周齡～8周齡Balb／c雌性小鼠，腹腔注射500μL弗氏不完全佐劑，7d后取生長旺盛的陽性雜交瘤細胞，腹腔注射0.5×106個／只～1×106個／只，注入細胞1周后，每天觀察小鼠腹部，待小鼠腹部明顯膨大時收集腹水，1 200r／min離心10min，收集上清置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 單克隆抗體的純化 采用正辛酸－硫酸銨的方法純化腹水［14］，具體純化過程如下：將制備的腹水1 000r／min離心15min后用0.45μm 濾器過濾，將濾液加入100mL燒杯中，用磁轉子邊攪拌邊將4倍體積60mmol／L（pH4.5）的醋酸緩沖液慢慢加入；緩慢滴入正辛酸使其終濃度為33μL／mL，室溫攪拌30min；8 000r／min離心30min后，收集上清；濾紙過濾，調(diào)pH 至7.4；邊攪拌濾液邊加入飽和（NH4）2SO4，待濾液呈現(xiàn)白色渾濁后，繼續(xù)攪拌10min；于4℃靜置5h后，4℃離心30min，棄上清；用10mmol Tris－HCl（pH9.0）重懸沉淀，裝入處理好的透析袋后放入100 倍體積的10 mmol Tris－HCl（pH9.0）中，磁力攪拌透析36h（4℃），期間每12h換液1次；最后3 000r／min離心15min，上清便是純化的單克隆抗體。取上清作SDS－PAGE 試驗，分析單抗大小及純化效果。

1.2.6 單克隆抗體的特性鑒定

1.2.6.1 腹水中單克隆抗體效價的測定 用重組β蛋白包被酶標板，采用間接ELISA 操作方法檢測制備的單克隆抗體的效價，其中二抗為HRP 標記的羊抗鼠IgG。

1.2.6.2 單克隆抗體特異性鑒定 將重組β毒素蛋白、本實驗室保存的粗提天然β毒素、重組α毒素蛋白和重組ε毒素蛋白分別包被96孔酶標板，用制備的各株單克隆抗體分別進行間接ELISA 方法的檢測，鑒定各株單克隆抗體的特異性。

1.2.6.3 單克隆抗體反應原性測定 用Western blot分析各株單克隆抗體分別與重組β毒素蛋白的反應性。

2 結果

2.1 免疫小鼠抗體效價檢測結果

前3次免疫后，用間接ELISA 方法檢測小鼠血清抗β毒素的效價結果均在1∶25 600以上，在此條件下進行加強免疫后，挑選效價最高的小鼠于4d后摘除脾臟進行細胞融合。

2.2 融合細胞的篩選及克隆

細胞融合后，選擇陽性孔OD 值高的，細胞集落數(shù)目較少，細胞生長狀態(tài)良好的孔進行克隆，經(jīng)過3次克隆，得到3株能穩(wěn)定分泌β毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1E6E11C7、2C8A5E8、1E3G10G9D9。

2.3 雜交瘤細胞株的建立

經(jīng)多次傳代培養(yǎng)，雜交瘤細胞生長旺盛，形態(tài)良好（圖1）。

圖1 雜交瘤細胞的生長狀態(tài)Fig.1 Growth state of the hybridoma

2.4 雜交瘤細胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性測定

將陽性雜交瘤細胞株連續(xù)培養(yǎng)3個月后，用已經(jīng)建立的間接ELISA 方法檢測一次各株細胞培養(yǎng)上清的抗體效價結果均為1∶25 600。說明經(jīng)過多次傳代后，各株雜交瘤細胞仍具有穩(wěn)定的分泌能力。

2.5 單克隆抗體亞類鑒定

利用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒檢測結果見表1，可 知 單 抗1E6E11C7、2C8A5E8 為IgG1 型，1E3G10G9D9為IgG2a型。

表1 單克隆抗體亞類鑒定結果Table 1 Results of isotype identification of monoclonal antibodies

圖2 腹水的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of ascitic fluids

2.6 單克隆抗體的純化

腹水經(jīng)正辛酸－硫酸銨法純化后，經(jīng)120g／L 的SDS－PAGE凝膠電泳試驗分析，可見兩條明顯的蛋白條帶，即53ku左右的重鏈和23ku左右的輕鏈，且無其他雜帶，表明純化效果好、純度較高（圖2）。

2.7 單克隆抗體的特性鑒定

2.7.1 腹水中單克隆抗體效價的測定 用間接ELISA 方法檢測腹水中單克隆抗體效價，用重組的β毒素作為抗原包被酶標板，用HRP標記的羊抗鼠抗體作為二抗（表2）。

2.7.2 單克隆抗體特異性鑒定 用間接ELISA 方法分別檢測各株單抗與重組β毒素蛋白、粗提天然β毒素、重組α毒素蛋白和重組ε毒素蛋白反應情況結果顯示，各株單抗均能與重組β毒素蛋白、天然β毒素反應且有較高效價，而不與重組α毒素蛋白和重組ε毒素蛋白反應（表3）。

表2 腹水中單克隆抗體效價檢測結果Table 2 The detection results of monoclonal antibody titers in ascites

表3 3株單克隆抗體特異性檢測結果Table 3 3strains of monoclonal antibody specificity test results

2.7.3 Western blot試驗結果 用Western blot方法分別檢測了各株單克隆抗體與重組β毒素反應性，試驗結果顯示（圖3），NC 膜上的條帶出現(xiàn)在38 ku處，與重組β毒素大小一致，這表明，試驗制得的單克隆抗體能特異性識別并結合重組β毒素。

3 討論

圖3 單克隆抗體的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of monoclonal antibody

單克隆抗體對操作技術的要求比較苛刻，因此在制備過程中每一步都要嚴格認真，只有每個細節(jié)都沒有失誤才能保證成功。在選擇抗原方面，要盡量選擇純度高、抗原性強的抗原來免疫動物，本研究經(jīng)原核表達的β毒素完全符合此要求，用其免疫動物，后期試驗才得以順利進行。在制備過程中，為了防止細胞被污染，對于所有細胞進行培養(yǎng)的過程中一定要做到嚴格無菌操作，細胞間使用前一定要進行紫外滅菌，所需試驗材料要提前進行高溫消毒殺菌。在用超凈工作臺進行操作前一定要對工作者進行消毒。

本試驗制備了3 株能穩(wěn)定分泌產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞。經(jīng)鑒定，單抗1E6、2C8為IgG1型，1E3為IgG2a型。對單抗進行亞類的鑒定是很重要的一步，就目前來說一般的制備技術制出的單抗大部分是IgG 類或IgM 類。IgG 類穩(wěn)定性較高，效價一般不會下降，而IgM 類的抗體本身就不太穩(wěn)定，效價隨時間推移可能出現(xiàn)降低，因此研究中一般不用IgM 類抗體做功能學試驗，只能簡單做細胞的表形分析，因此關于單抗的制備，要盡量制得IgG亞類單抗。

單克隆抗體在畜牧領域的應用越來越廣泛，而其純度與活性是影響其質(zhì)量的關鍵因素。當前實驗室常用的小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b類單克隆抗體純化方法中，常用沉淀法和層析法［16］。本研究采用正辛酸－硫酸銨沉淀法進行腹水的純化，試驗證明此方法純化效果良好。與層析法相比正辛酸－硫酸銨沉淀法操作簡便，抗體回收率高，抗體活性高，生產(chǎn)成本較低。利用此方法純化單克隆抗體，有一定的應用價值。

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