含查爾酮結(jié)構(gòu)（E）－4－［3－（取代苯基）丙烯酰基］苯甲酸鈉的制備及抑菌活性研究

郭沂濤，劉希望，楊亞軍，許春燕，李劍勇

（甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050）

查爾酮類化合物廣泛存在于自然界中，是一類廣泛存在于藥用植物中的天然有機(jī)化合物，其基本骨架結(jié)構(gòu)為1，3－二苯基丙烯酮［1］。由于查爾酮類化合物分子具有較大的柔性，能與不同的受體結(jié)合，顯示出廣泛的生物學(xué)活性，如抗炎、抗腫瘤、抗菌等［2－4］。研究顯示，查爾酮是一類具有顯著抗寄生蟲活性的化合物，如甘草查爾酮A，最早從中藥甘草的根中提取得到，對對氯喹有耐藥性的瘧原蟲有較好的抑制作用［5］。此后，國內(nèi)外學(xué)者不斷報(bào)道了查爾酮類衍生物的合成及其抗寄生蟲活性研究，許多化合物顯示出較高的抗利士曼原蟲、瘧原蟲活性［6－9］。與此同時，不斷有新的查爾酮類化合物被合成出來，并表現(xiàn)出顯著的抑菌活性［10－12］。

艱難梭菌是一種厭氧菌，是動物和人腸道中的正常菌群，與大部分畜禽體內(nèi)寄生蟲一樣，屬于專性厭氧微生物。艱難梭菌是馬、牛、豬腸道中的病原菌，在仔豬疾病中，艱難梭菌的感染率高達(dá)90%［13］?？紤]到許多查爾酮類化合物對艱難梭菌有較強(qiáng)抑制作用［14］，同時對寄生蟲也具有具有生物活性，可以通過體外試驗(yàn)初步篩選具有潛在抗寄生蟲活性的化合物，從而提高篩選效率，降低篩選難度。本文合成了一系列具有（E）－4－［3－（取代苯基）丙烯?；荼郊姿徕c結(jié)構(gòu)的查爾酮類化合物，運(yùn)用核磁共振氫譜及高分辨質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，考察了目標(biāo)的化合物體外抑菌活性，尤其是對艱難梭菌的抑菌活性，為尋找新的抗菌化合物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 取代苯甲醛、4－乙?；郊姿幔ǚ治黾儯凫`威試劑公司產(chǎn)品；氨芐西林、環(huán)丙沙星及甲硝唑，Sigma 公司產(chǎn)品；甲醇、二甲基亞砜（DMSO）（分析純），國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；MH 肉湯培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽（PBS），英國OXOID 公司產(chǎn)品；厭氧培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；瓊脂，鄭州藍(lán)宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品；6cm 培養(yǎng)皿、針頭式濾器，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；U 型底96孔板，美國Corning公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株 艱難梭菌（Clostridium difficile，ATCC 43593）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CICC22949）、大腸埃希菌（Escherichia coli，CICC10899）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC27217），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.3 儀器 Aglient 600 MHz DD2 核磁共振儀、Aglient 6530型液相色譜飛行時間質(zhì)譜串聯(lián)儀，美國安捷倫公司產(chǎn)品；SW－CJ－2PD 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LDIX－30KBS型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；DNP－9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Forma 厭氧培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品；CPA224S 型電子分析天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；Vortex 渦旋振蕩儀，美國Scientific Industries公司產(chǎn)品；Speceramax M2多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司產(chǎn)品；CO 8000型細(xì)胞密度計(jì)，英國Biochrom 公司產(chǎn)品；移液器，德國艾本德公司產(chǎn)品；Direct－Q 3 超純水系統(tǒng)，美國密理博公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 （E）－4－［3－（取代苯基）丙烯?；荼郊姿徕c的合成 參照文獻(xiàn)［15］，將6 mmol的4－乙?；郊姿?、6.6mmoL的取代苯甲醛溶于30mL甲醇，加0.04g／mL的氫氧化鈉水溶液15 mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h，有固體沉淀生成，抽濾，用大量水洗、甲醇淋洗得微黃色固體產(chǎn)物，合成路線圖見圖1。

1.2.2 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征 核磁共振氫譜采用Aglient 600MHz DD2 核磁共振儀，以氘代DMSO 為溶劑將少量目標(biāo)化合物溶解，以四甲基硅烷為參考，進(jìn)行目標(biāo)化合物的氫核磁共振檢測。

高分辨質(zhì)譜采用Aglient 6530 型液相色譜飛行時間質(zhì)譜串聯(lián)儀，先將少量目標(biāo)化合物用適量甲醇溶解，過濾后裝入樣品瓶中待檢測。其中，離子源為ESI源；檢測模式為負(fù)離子模式；干燥氣溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓4 000V；碎裂電壓為135V；色譜柱為Aglient Extend－C18柱（1.8μm，2.1mm×50mm）；流動相為甲醇－水（80∶20，V／V）；流速0.2mL／min；進(jìn)樣量為2μL。

圖1 目標(biāo)化合物1～12合成路線圖Fig.1 Synthesis of compounds 1－12

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌采用瓊脂稀釋法測定其MIC 值［16］。將化合物用DMSO 配成濃度為1.28 mg／mL 的原始濃度藥液，用液體培養(yǎng)基倍比稀釋成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg／mL 濃度的藥液。分取上述不同濃度藥液稀釋1mL 加至9 mL 的瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后倒平板，得到含藥濃度為別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg／mL 的瓊脂平板。將艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌厭氧培養(yǎng)18h后，用培養(yǎng)基稀釋至濃度為OD 600nm＝0.1（含菌量約為107CFU／mL）。用移液器分別在上述含藥瓊脂平板表面點(diǎn)種10μL 菌懸液，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，目測有無菌落生長。沒有加入化合物的平板作為空白對照組，加入甲硝唑的平板作為藥物對照組。

革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌采用微量肉湯稀釋法測定其最小抑菌濃度［17］。首 先 將 化 合 物 用 DMSO 制 成 濃 度 為1mg／mL的溶液，用MH 肉湯倍比稀釋至濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg／mL 備 用。細(xì)菌復(fù)蘇后接種到含MH 肉湯培養(yǎng)基的滅菌試管中培養(yǎng)2h～4h，用細(xì)菌密度測試儀測定菌懸液濃度并調(diào)節(jié)至0.5 麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)（1×108CFU／mL～2×108CFU／mL）備用。用PBS 液將菌懸液做1∶10稀釋，取96孔板，每孔加入97.5μL 的含有不同濃度化合物的MH 肉湯，然后加入用PBS液稀釋好的菌懸液2.5μL，每孔的總體積為100μL，同時設(shè)置空白對照組、氨芐西林和環(huán)丙沙星藥物對照組。放入恒溫培養(yǎng)箱37℃恒溫過夜培養(yǎng)18h～24h后，在黑暗背景下肉眼觀察混合物清亮，孔底無菌落形成的最低濃度即為化合物的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

（E）－4－［3－（2－氟苯基）丙烯酰基］苯甲酸鈉（1），微 黃 色 固 體 1.18 g，產(chǎn) 率 73%；1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.23－7.90（m，6H），7.80（d，J＝15.7Hz，1H），7.49（s，1H），7.38－7.22（m，2H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H10FO3［M－Na］－269.061 9，實(shí)測值269.062 1。

（E）－4－［3－（3－氟苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（2），微 黃 色 固 體 0.92 g，產(chǎn) 率 57%；1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.12－7.93（m，5H），7.84（d，J＝10.0Hz，1H），7.75－7.63（m，2H），7.47（s，1H），7.26（s，1H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H10FO3［M－Na］－269.061 9，實(shí) 測 值269.062 4。

（E）－4－［3－（4－氟苯基）丙烯酰基］苯甲酸鈉（3），微 黃 色 固 體 1.23 g，產(chǎn) 率 72%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.11（s，2H），8.04－7.93（m，4H），7.90（d，J＝15.6 Hz，1H），7.73（d，J＝15.8Hz，1H），7.28（s，2H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算 值C16H10FO3［M－Na］－269.061 9，實(shí) 測 值269.062 4。

（E）－4－［3－（2－氯苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（4），微 黃 色 固 體 1.13 g，產(chǎn) 率 70%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.21（d，J＝7.1 Hz，1H），8.10－7.92（m，6H），7.55（d，J＝7.2 Hz，1H），7.53－7.37（m，2H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H10ClO3［M－Na］－285.032 4，實(shí)測值285.031 8。

（E）－4－［3－（3－氯苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（5），微 黃 色 固 體 1.43 g，產(chǎn) 率 83%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.15－7.76（m，7H），7.68（d，J＝15.6Hz，1H），7.53－7.35（m，2H）.HRMS（ESI）：計(jì)算值C16H10ClO3［M－Na］－285.032 4，實(shí)測值285.031 7。

（E）－4－［3－（4－氯苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（6），微 黃 色 固 體 1.53 g，產(chǎn) 率 89%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.02（d，J＝7.8 Hz，2H），7.98－7.86（m，5H），7.68（d，J＝15.5 Hz，1H），7.49（d，J＝8.1Hz，2H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H10ClO3［M－Na］－285.0324，實(shí) 測 值285.032 8。

（E）－4－［3－（3－硝 基 苯 基）丙 烯 酰 基］苯 甲 酸 鈉（7），微 黃 色 固 體1.62 g，產(chǎn) 率91%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.76（s，1H），8.45－7.62（m，9H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H10NO5［MNa］－296.056 4，實(shí)測值296.057 0。

（E）－4－［3－（4－硝 基 苯 基）丙 烯 酰 基］苯 甲 酸 鈉（8），微 黃 色 固 體0.85 g，產(chǎn) 率48%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.25（s，2H），8.22－8.02（m，5H），7.97（s，2H），7.78（d，J＝15.5 Hz，1H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H10NO5［M－Na］－296.056 4，實(shí)測值296.057 9。

（E）－4－［3－（4－三氟甲基苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（9），微 黃 色 固 體1.27g，產(chǎn) 率66%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.16－7.69（m，10H）.HR－MS（ESI）：計(jì) 算 值C17H10F3O3［M－Na］－319.058 8，實(shí)測值319.059 2。

（E）－4－［3－（4－甲氧基苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（10），微 黃 色 固 體0.86 g，產(chǎn) 率50%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.02（d，J＝7.6 Hz，2H），7.96（d，J＝7.3 Hz，2H），7.83（d，J＝7.9Hz，2H），7.78（d，J＝15.5 Hz，1H），7.68（d，J＝15.5 Hz，1H），6.99（d，J＝8.0 Hz，2H），3.79（s，3H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C17H13O4［M－Na］－281.081 9，實(shí)測值281.082 3。

（E）－4－［3－（2，4－二氯苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（11），微 黃 色 固 體1.35 g，產(chǎn) 率78%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.25（s，1H），8.15－7.86（m，6H），7.73（s，1H），7.53（s，1H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H9Cl2O3［M－Na］－318.993 4，實(shí)測值318.993 4。

（E）－4－［3－（2，4－二氟苯基）丙烯?；荼郊姿徕c（12），微 黃 色 固 體1.78 g，產(chǎn) 率92%。1H－NMR（600 MHz，DMSO－d6）δ8.22（s，1H），8.14－7.87（m，5H），7.75（d，J＝15.5 Hz，1H），7.37（s，1H），7.21（s，1H）.HR－MS（ESI）：計(jì)算值C16H9F2O3Na［M－Na］－287.052 5，實(shí)測值287.052 9。

以化合物12為例，其核磁共振氫譜及高分辨質(zhì)譜圖見圖2和圖3。

圖2 化合物12 的核磁共振氫譜圖Fig.2 1H－NMR spectra of compound 12

其中，δ8.22（s，1H）為A 環(huán)3 位上的氫；δ 8.14－7.87（m，5H）為B環(huán)的4個氫和雙鍵2位的1個氫重疊形成的多重峰；δ7.75（d，J ＝15.5Hz，1H）為雙鍵1位上的氫；δ7.37（s，1H）為A 環(huán)5位上的氫；δ7.21（s，1H）為A 環(huán)6位上的氫。

化合物12分子式為C16H9F2O3Na，是一種鈉鹽，易于形成負(fù)離子，以ESI源負(fù)離子模式測定其分子 離 子 峰［M－Na］－為287.052 5，計(jì) 算 值 為287.052 9，二者之間誤差在可接受范圍之內(nèi)。

圖3 化合物12 的高分辨質(zhì)譜圖Fig.3 High resolution mass spectroscopy of compound 12

2.2 目標(biāo)化合物的抑菌活性

用瓊脂稀釋法測定了目標(biāo)化合物對艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值，用微量肉湯稀釋法測定了目標(biāo)化合物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC值（表1）。

表1 目標(biāo)化合物對4種菌的最小抑菌濃度Table 1 MIC values of target compounds against the 4bacterial strains （μg／mL）

從表1中可以看出，化合物9和11對艱難梭菌具有中等的抑制作用，MIC 值均為8μg／mL?；衔?和12對艱難梭菌有較高的抑制作用，MIC 值稍高于對照藥物甲硝唑?；衔?1對產(chǎn)氣莢膜梭菌有明顯抑制作用，MIC 值與對照藥物甲硝唑相當(dāng)?；衔?和11對金黃色葡萄球菌顯示一定的抑制作用，MIC值分別為8μg／mL和2μg／mL。目標(biāo)化合物對革蘭陰性菌大腸埃希菌無明顯抑制作用，MIC值均大于64μg／mL。化合物12對艱難梭菌的體外抑菌活性見圖4。

圖4 化合物12 對艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抑菌活性Fig.4 Antibacterial activities of compound 12against Clostridium difficile and Clostridium perfringens

3 討論

查爾酮骨架結(jié)構(gòu)1，3－二苯基丙烯酮的通常由相應(yīng)的醛和含有α位H 原子的酮通過克萊森－斯密特縮合反應(yīng)制得。本文以取代苯甲醛、4－乙酰基苯甲酸為原料，用氫氧化鈉作堿，甲醇作溶劑高產(chǎn)率的制備了12個新型含有查爾酮結(jié)構(gòu)（E）－4－［3－（取代苯基）丙烯?；荼郊姿徕c類化合物。制備的化合物結(jié)構(gòu)簡單、合成條件簡潔、后處理簡單，化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)高分辨質(zhì)譜及核磁共振氫譜確證。體外抑菌試驗(yàn)表明，部分合成的化合物對厭氧菌艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有較好的抑制作用，MIC 值與對照藥物甲硝唑相當(dāng)或稍弱?；衔?和11對金黃色葡萄球菌顯示一定的抑制作用，大部分化合物對大腸埃希菌無明顯抑制作用。構(gòu)效關(guān)系分析顯示，4－氯取代的化合物6和2，4－二氟取代的化合物12對艱難梭菌顯示出較高的抑制作用；2，4－二氯取代化合物11對除了大腸埃希菌之外其他3種菌都顯示出較高的抑制作用。化合物6、9、11和12可作為有潛在抗寄生蟲活性的備選化合物，相應(yīng)的抗寄生蟲活性有待進(jìn)一步研究。

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