副豬嗜血桿菌β－半乳糖苷酶的原核表達(dá)與活性檢測

劉英玉，夏利寧，劉俊飛，姚 剛，何啟蓋

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆天康畜牧科技有限公司，新疆昌吉830011；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬群上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下可以侵入機(jī)體并引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征，該病又稱為Glasser′s disease［1］。蔡旭旺等［2］對HPS做 了生化鑒定，大多數(shù)生化反應(yīng)較弱，對糖類發(fā)酵多不穩(wěn)定，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D－核糖和麥芽糖，不發(fā)酵甘露糖、木糖、L－阿拉伯糖、蜜三糖，少數(shù)菌株發(fā)酵乳糖。

β－半乳糖苷酶（β－galactosidase，BgaC）又稱乳糖酶，是一種能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶，是白色或淡黃色粉末，無臭，微甜，分子質(zhì)量為100ku～850ku。在水中呈混沌液（大部分溶解），不溶于乙醇、丙酮。該酶主要分布在植物、微生物及哺乳動物腸內(nèi)，其與食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生較為密切，因而研究較多。不同來源的微生物BgaC 在酶學(xué)性質(zhì)上差別較大，如分子質(zhì)量、最適溫度、最適pH 和熱穩(wěn)定性等。一般說來，霉菌產(chǎn)生的BgaC 是胞外酶，較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高，最適pH 偏酸性，一般在3～4 左右［3］。細(xì)菌BgaC 通常也是胞內(nèi)酶，最適pH 中性附近，最適溫度比酵母菌稍高，但高溫菌BgaC 的最適溫度可以很高，熱穩(wěn)定性也較好。大腸埃希菌（Escherichia coli）BgaC 是迄今為止研究最深入、了解最透徹的一種酶，商品化產(chǎn)品已大量應(yīng)用于生化分析中。近年來，肺炎鏈球菌β－半 乳 糖 苷 酶 的 研 究 比 較 多，Campuzano S 等［4］對輕型鏈球菌NCTC 12261菌株進(jìn)行β－半乳糖苷酶的克隆表達(dá)和酶活性特性研究，該酶編碼2 411個氨基酸，分子質(zhì)量為268ku，推測該蛋白包含1 個N－末端的信號肽和C－末端的膽堿結(jié)合域由5 個固定重復(fù)結(jié)構(gòu)組成，此結(jié)構(gòu)便于定向?yàn)榧?xì)胞壁分泌酶。酶比活力為2 500U／mg，最適pH 為6.0～6.5，最適溫度為30 ℃～40 ℃，在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用具有特有的特性。

β－半乳糖苷酶基因被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究當(dāng)中，包括載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因研究、基因治療等多個領(lǐng)域。不同來源BgaC 在性質(zhì)上的差異為尋找優(yōu)良特性的酶源提供了可能性。副豬嗜血桿菌SH0165 菌株基因組DNA（GenBank accession number：CP001321）已完成測序［5］。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)存在BgaC 基因，本研究進(jìn)一步對BgaC氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并通過原核表達(dá)和β－半乳糖苷酶的活性測定來研究其的酶學(xué)特性，為其生產(chǎn)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 副豬嗜血桿菌SH0165用胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基中加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）和新生牛血清來培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是在37 ℃，靜置培養(yǎng)24h～48h。E.coli菌株用LB 固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。副豬嗜血桿菌SH0165、質(zhì)粒pET32a、大腸埃希菌BL21（DE3）和感受態(tài)細(xì)菌DH5α，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動物病原分子流行病學(xué)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 鄰硝基苯β－D－半乳吡喃糖苷（o－nitropheyl－β－D－galactopyranoside，ONPG）、β－巰基乙醇、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素，Sigma公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ和HindⅢ）、T4DNA 連接 酶、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；新生牛血清，四季青公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、小提質(zhì)粒試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；PCR 儀、SDS－PAGE垂直電泳儀、酶標(biāo)儀、TSA，Bio－Rad公司產(chǎn)品；凝膠電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Gene Company公司產(chǎn)品；NAD，中國上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；Ni－NTA 親和層析樹脂，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BgaC 基因的克隆和分析 參考GenBank中HPS SH0165基因組的序列設(shè)計(jì)BgaC 基因的全長引物，引物序列為BgaC－S：CGGGATCCATGCCTTTCCAAATCGGCGAAA；BgaC－A：GGAAGC TTTTATAAGTTCTTCGTATTCAAC。引物序列增加了酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ，引物濃度10 μmol／L。通過煮沸法提取副豬嗜血桿菌SH0165的模板，反應(yīng)體系50μL：10×buffer 5μL dNTPs 4μL，Taq 酶0.25μL，模板4μL，引物各1μL，H2O 46.75μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94℃30s，58 ℃30s，72 ℃2min，35循環(huán)；72 ℃10 min。取7μL反應(yīng)液進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)目的條帶則用天根公司的膠回收試劑盒回收目的條帶，將目的片段用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切處理的pET－32a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，以PCR 和限制性酶切篩選獲得陽性克隆進(jìn)行測序，將測序得到的序列進(jìn)行拼接，然后利用Blastn對核苷酸序列進(jìn)行比對，用Blastp及ExPASy在線分析軟件對蛋白序列進(jìn)行分析，用Mega軟件對B－Gal基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.2 BgaC基因的表達(dá)和純化 測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌BL21，采用限制性酶切篩選獲得陽性克隆的BL21菌體培養(yǎng)至OD 600nm≈0.6，加終濃度為0.1mmol／L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5h，收集菌液，6 500r／min離心5min，去上清后用0.1倍體積的ddH2O 將菌體混懸均勻，在冰上用超聲波破碎菌體，12 000r／min離心30min，收集上清液。用Ni－NTA 親和層析樹脂（Invitrogen）純化含有（his）6標(biāo)簽的重組蛋白，參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。蛋白的純度用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進(jìn)行分析驗(yàn)證，純化后的蛋白采用1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法）測定［6］，蛋白含量以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物。最終，重組蛋白HP0245EC凍存于－20 ℃。

1.2.3 β－半乳糖苷酶活性的測定 酶活性測定方法根據(jù)文獻(xiàn)［6］：將BgaC 蛋白用1mL 反應(yīng)液中［Z buffer，每50 mL：0.80 g Na2HPO4·7H2O（0.06mol／L），0.28 g NaH2PO4·H2O（0.04 mol／L），0.5mL KCl（0.01mol／L）；0.05mL Mg－SO4（0.001 mol／L），0.135 mLβ－巰基乙醇（BME）（0.05mol／L），加入40mL H2O 后調(diào)整pH 為7.0，定容至50mL，保存于4 ℃］混勻后，加入0.1mL生色底物ONPG（0.008g／mL）；在37 ℃下孵育30 min；加入0.5mL終止液（1mol／L Na2CO3）終止反應(yīng)；取溶液上清，測量420nm 和550nm 下的吸光度。酶活性測定采用一式3 份。1 個酶活性單位（U）是指在特定條件下，在1 min內(nèi)能水解1nmol底物的酶量。比活性為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用U／mg蛋白質(zhì)表示。

測定反應(yīng)液pH 對重組菌酶活性作用的影響，根據(jù)酶活性測定方法選擇pH5～9，孵育30min來測定420nm 和550nm 下的吸光度，其中pH5～5.5用弱鹽酸溶液調(diào)節(jié)，pH6～9用低濃度NaOH 調(diào)節(jié)。測定溫度對重組菌酶活性作用的影響，根據(jù)酶活性測定方法選擇溫度范圍在0 ℃～64 ℃［7］，孵育30min測定420nm和550nm 的吸光度。酶活性測定采用一式3份。

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌BgaC基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 副豬嗜血桿菌BgaC 氨基酸序列同源性分析 通過BgaC－S和BgaC－A 引物擴(kuò)增副豬嗜血桿菌SH0165 菌 株，得 到1 791bp 的DNA 條 帶，將PCR 產(chǎn)物酶切后與載體pET－32a進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，挑取鑒定正確的重組菌進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中副豬嗜血桿菌SH0165 的BgaC 基 因 序 列（ACL31886.1）具 有100%的符合率。Blastp比對結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌BgaC 氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他微生物的BgaC基因氨基酸序列的相似性不高。其中，副豬嗜血桿菌BgaC 氨基酸序列與溶血性曼氏桿菌A1／A6PKL10BgaC（EXI62636.1）的相似性最高為82%。ExPASy 在線分析表明，副豬嗜血桿菌BgaC氨基酸序列是屬于糖苷水解酶家族35（glycoside hydrolase family 35，CH35）的成員家族，EC 3.2.1.－，催化質(zhì)子的供體是谷氨酸（Glu），β－半乳糖苷酶有1個TIM 筒結(jié)構(gòu)和2個完整的β區(qū)域。

所有序列是通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載的（NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：www.ncbi.nlm.nih.gov）。多序列比對是根據(jù)Cheng W［8］和Jeong J K［9］，使用的軟件是Lasergene7.1和MEGA6。如圖1 所示，采用黑色三角形標(biāo)記半乳糖結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸，采用黑色圓形標(biāo)記3 個芳香族殘基位點(diǎn)色氨酸240 和色氨酸243，酪氨酸455，環(huán)LA（Trp240－Asp255）和環(huán)LB（Glu448－Ala461）結(jié)構(gòu)采用黑色箭頭表示，守衛(wèi)在活性位點(diǎn)口袋狀區(qū)域的表面啞鈴型通道處，且發(fā)現(xiàn)3個芳香族殘基位點(diǎn)色氨酸240和色氨酸243，酪氨酸455是此通道的峽部。副豬嗜血桿菌BgaC 有7 個高度保守的區(qū)域，采用灰色方框標(biāo)記，2個氨基末端區(qū)域（domains 1 和2），3 個 小 的 中 心 區(qū) 域 群（domains 3，4和5），2個小的羧基末端區(qū)域（domains 6和7）和NHL 同源序列（the NHL repeat homologous domain）。

圖1 序列比較不同病原體的BgaC同源性Fig.1 BgaC homology of sequence comparison of various organisms

2.1.2 副豬嗜血桿菌BgaC氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 用Mega 6.0軟件對β－半乳糖苷酶基因的氨基酸序列與GenBank中已登錄的其他細(xì)菌的β－半乳糖苷酶基因氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，如圖2所示，12類的β－半乳糖苷酶基因被聚為3個大類群，副豬嗜血桿菌SH0165BgaC 基因與溶血性曼氏桿菌PKL10 親緣關(guān)系最近，并且與糞腸球菌DENG1（BgaB）、肺炎鏈球菌TIGR4、科里氏桿菌屬PW2、蘇云金芽胞桿菌和糞腸球菌DENG1（LacZ）聚為一類，擬南芥、大熊貓、芽胞桿菌、鏈霉菌屬M(fèi)g1和多形擬桿菌VPI－5482聚為一類，而乳酸桿菌單獨(dú)成一類，與副豬嗜血桿菌SH0165的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2 重組pET－32a＋BgaC的表達(dá)和生物學(xué)特征

2.2.1 重組pET－32a＋BgaC 基因克隆與表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET32a＋BgaC轉(zhuǎn)入受體菌BL21，經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)化成功后，用IPTG 對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后進(jìn)行破碎，離心取上清作為粗體重組菌pET32a＋BgaC。用His標(biāo)簽純化樹脂純化離心后的上清，最后洗脫的蛋白是攜帶His標(biāo)簽的BgaC蛋白。通過SDS－PAGE 檢測重組菌pET32a＋BgaC和純化后BgaC 蛋白的表達(dá)情況（圖3），pET32a＋BgaC重組菌表達(dá)蛋白為82.4ku。

圖2 不同來源β－半乳糖苷酶基因的氨基酸序列聚類分析（括號中為各物種氨基酸序列GenBank登錄號）Fig.2 The cluster analysis based on alignment of amino acid sequences among UPGMA and some publishedβ－Gal genes of other species in GenBank database.Amino acid sequences accession №in GenBank of different species is in brackets

圖3 SDS－PAGE鑒定誘導(dǎo)表達(dá)pET32a＋BgaC重組蛋白和純化BgaC蛋白Fig.3 Identification of induced expression of pET32a＋BgaC recombinant protein and purified BgaC protein by SDS－PAGE

2.2.2 測定純化BgaC蛋白的酶活性和pET－32a＋BgaC重組蛋白的生物學(xué)特征 采用考馬斯亮藍(lán)法做出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2＝0.978 4。在OD 595nm 處分別測定pET32a＋BgaC 重組蛋白和BgaC 純 化 蛋 白 的 含 量 為3.8 mg／mL 和0.7 mg／mL。按照酶活性測定方法取4μL BgaC純化蛋白（0.7mg／mL）作為底物來測定酶的活性，該酶的活性單位為5U，酶比活力為1 795U／mg。

取6μL 粗提的pET32a＋BgaC 重組蛋白（3.8 mg／mL）測定pH5～9范圍內(nèi)的酶活性（圖4），pH6～7時的酶活性可達(dá)到180U，在此pH 范圍內(nèi)副豬嗜血桿菌的BgaC活性能夠起到較理想的催化作用。取6 μL 粗 提 的pET32a＋BgaC 重 組 蛋 白（3.8 mg／mL）測定溫度在0℃～64℃的酶活性（圖5），溫度在30 ℃～37 ℃時的酶活性可達(dá)到180 U，30 ℃～37 ℃時副豬嗜血桿菌的BgaC活性的最佳溫度。

圖4 不同pH 的酶活性測定Fig.4 Detection of enzyme activities in various pHs

圖5 測定不同溫度的酶活性Fig.5 Detection of enzyme activities in various temperatures

3 討論

β－半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）廣泛的應(yīng)用于乳品工業(yè)和分子生物學(xué)研究［10－11］。β－半乳糖苷酶是糖苷水解酶的一種，可以將乳糖等含β－半乳糖苷雙糖和寡糖降解為單糖，為生物提供可利用的碳素營養(yǎng)［12］。經(jīng)過長期的自然進(jìn)化，微生物為了適應(yīng)不同的生活環(huán)境，自然界的廣泛分布的β－半乳糖苷酶被分成了許多種類。根據(jù)氨基酸序列的相似性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，β－半乳糖苷酶可以分別歸入糖苷水解酶1、2、35 和42 家 族（glycoside hydrolase family，GHF）［13］。家族之間的氨基酸序列相似性很低，每個家族具有獨(dú)特的保守結(jié)構(gòu)域。為了方便研究糖苷酶的作用機(jī)理，Henrissat B［14］提出了一種新的序列分類法，該方法具有方便獲取糖苷酶結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理信息，顯示酶之間相互進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測未知酶的功能區(qū)域的優(yōu)點(diǎn)。隨著細(xì)菌全基因組測序的進(jìn)行，在更多的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了該酶。副豬嗜血桿菌BgaC是屬于CH35家族的成員，但其具體生物活性研究還沒有報(bào)道。Jeong J K 等［15］報(bào)道肺炎鏈球菌BgaC的序列比較，發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌BgaC 氨基酸序列中存在7個高度保守的區(qū)域，2個氨基末端區(qū)域，3個小的中心區(qū)域群，2個小的羧基末端區(qū)域和NHL同源序列［9］，通過構(gòu)建突變株研究發(fā)現(xiàn)BgaC蛋白在鏈球菌的黏附性和致病性方面具有重要意義。副豬嗜血桿菌BgaC氨基酸序列與肺炎鏈球菌TIGR4β－半乳糖苷酶的相似性雖然只有54%，但通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌BgaC也存在7個高度保守的區(qū)域，與肺炎鏈球菌報(bào)道的一致。越來越多的證據(jù)證明感染肺炎球菌可以導(dǎo)致宿主中聚糖發(fā)生變化，肺炎鏈球菌可以通過胞外糖苷酶活性修飾N 端－連接的聚糖，O 端－連接的聚糖和氨基多糖途徑。鏈球菌和副豬嗜血桿菌都是上呼吸道病原菌，且都是營養(yǎng)苛刻性細(xì)菌，菌落形態(tài)相似，豬只感染后臨床癥狀會出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液，胸膜炎和腦膜炎的癥狀，預(yù)測肺炎鏈球菌與副豬嗜血桿菌在β－半乳糖苷酶具有類似的功能，值得我們進(jìn)一步研究。

1998年β－半乳糖苷酶被中國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化委員會列為食品添加劑新酶種。目前應(yīng)用于乳品工業(yè)的β－半乳糖苷酶多來自于酵母、曲霉菌或乳酸菌。Nguyen等提純了嗜酸乳桿菌R22菌株的LacLM，通過研究酶學(xué)特性確認(rèn)該酶可用于乳品工業(yè)［16］。BgaC除參與乳糖的消化吸收外，也是水解蛋白多糖的重要水解酶。主要用于乳品工業(yè)，加入乳品中可使乳糖分解為半乳糖和果糖而促進(jìn)其消化的酶，降低乳糖結(jié)晶析出并增加甜度。Campuzano S等［4］對慢型鏈球菌NCTC 12261菌株進(jìn)行β－半乳糖苷酶的研究，發(fā)現(xiàn)β－半乳糖苷酶由2 411個氨基酸編碼，分子質(zhì)量為268ku，酶比活力為2 500U／mg，最適pH為6.0～6.5，最適溫度為30 ℃～40 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的副豬嗜血桿菌β－半乳糖苷酶分子質(zhì)量為82.4ku，酶比活力為1 795 U／mg，最適pH 為6.0～7.0，最適溫度為30 ℃～37 ℃。與慢型鏈球菌NCTC 12261菌的BgaC進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌BgaC 蛋白的分子質(zhì)量較小，但酶比活力、最適pH 和最適溫度的差別不是很大。副豬嗜血桿菌BgaC蛋白具有糖苷酶活性，能夠介導(dǎo)糖蛋白的降解。

β－半乳糖苷酶可用作酶免分析的標(biāo)記酶，中性β－半乳糖苷酶（SA－β－gal）是一種很好的可用于體內(nèi)外衰老研究的生物學(xué)標(biāo)志［3］。β－半乳糖苷酶基因在基因工程中的應(yīng)用包括作為報(bào)告基因構(gòu)建載體轉(zhuǎn)基因研究和基因治療等多個分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。目前分子生物學(xué)研究中使用的克隆載體一般都具有一段大腸埃希菌β－半乳糖苷酶的啟動子及其α肽鏈的DNA 序列，可通過藍(lán)白菌的顏色變化篩選出陽性重組載體菌［17］。在基因治療方面，F(xiàn)ukui T 等［18］為了探討基因治療用于口腔癌的可能性，將含β－半乳糖苷酶基因的腺伴隨病毒載體轉(zhuǎn)染人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株，通過檢測β－半乳糖苷酶的表達(dá)情況來研究轉(zhuǎn)染的效率。Terra V S等［19］研究表明肺炎鏈球菌中β－半乳糖苷酶能夠從宿主糖苷類代謝中獲得能量，證明宿主體內(nèi)有效的糖蛋白降解與肺炎球菌的毒力有關(guān)，該蛋白可用于分子診斷和亞單位疫苗的候選基因。副豬嗜血桿菌β－半乳糖苷酶是分子質(zhì)量較小的糖苷酶蛋白，在氨基酸序列上存在高度保守的區(qū)域，該蛋白也具有較高糖苷酶活性，因此，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

［1］ 劉英玉.副豬嗜血桿菌耐藥性調(diào)查和耐藥機(jī)制研究［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［2］ 蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（24）：55－58.

［3］ 郭志華.產(chǎn)β－半乳糖昔酶芽抱桿菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.山東青島：山東大學(xué)，2009.

［4］ Campuzano S，Serra B，Llull D，et al.Cloning，expression，and characterization of a peculiar choline－binding beta－galactosidase fromStreptococcus mitis［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75（18）：5972－5980.

［5］ Yue M，Yang F，Yang J，et al.Complete genome sequence of Haemophilus parasuis SH0165［J］.Bacteriol J，2009（191）：1359－1360.

［6］ Bradford M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Anal Biochem，1976（72）：248－254.

［7］ Miller J H.Experiments in molecular genetics［M］.Cold Spring Harbor：NY，1972.

［8］ Cheng W，Wang L，Jiang Y L，et al.Structural insights into the substrate specificity of Streptococcus pneumoniaeβ（1，3）galactosidase BgaC［J］.Biol Chem J，2012，287（27）：22910－22918.

［9］ Jeong J K，Kwon O，Lee Y M，et al.Characterization of the Streptococcus pneumoniae BgaC protein as a novel surface－galactosidase with specific hydrolysis activity for the Gal1－3GlcNAc moiety of oligosaccharides［J］.Bacteriol J，2009，191（9）：3011－3023.

［10］ Chen W，Chen H，Xia Y，et al.Production，purification，andcharacterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysisfromBacillus stearothermophilus［J］.J Dairy Sci，2008，91（5）：1751－1758.

［11］ Ravelojaona V，Robert A M，Robert L.Expression of senescence－associated beta－galactosidase（SA－beta－Gal）by human skin fibroblasts，effect of advanced glycation end－products and fucose or rhamnose－rich polysaccharides［J］.Arch Gerontol Geriatr，2009，48（2）：151－154.

［12］ 汪 川，張朝武，余 倩，等.保加利亞乳桿菌產(chǎn)β－半乳糖苷酶特性的研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32（10）：1274－1277.

［13］ Hidaka M，F(xiàn)ushinobu S，Ohtsu N，et al.Trimeric crystal structure of the glycosidehydrolase family 42 beta－galactosidase fromThermus thermophilus A4and thestructure of its complex with galactose［J］.J Mol Biol，2002，322（1）：79－91.

［14］ Henrissat B.A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities［J］.Biochem J，1991，280：309－316.

［15］ King S J.Pneumococcal modification of host sugars：a major contributor to colonization of the human airway［J］.Mol Microbiol，2010，25（1）：15－24.

［16］ 潘 渠.嗜酸乳桿菌lac基因簇兩個β－半乳糖苷酶基因的克隆表達(dá)和功能研究［D］.四川重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2008.

［17］ 張 莉，李慶章，田 雷.β－半乳糖苷酶研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（7）：128－131.

［18］ Fukui T，Hayashi Y，Kagami H，et al.Suicide gene therapy for human oral squamous cell carcinoma cell lines with adeno－associated virus vector［J］.Oral Oncol，2001，37（3）：211－215.

［19］ Terra V S，Homer K A，Rao S G，et al.Characterization of novelβ－galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae［J］.Infect Immun，2010，78（1）：348－357.