不同雙水相提取山藥總黃酮的研究*

孫亞琴，王香愛(ài)，張 茜

(渭南師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西 渭南 714000)

山藥(Chinese Yam)，又名薯蕷、白薯、土薯、薯藥，為薯蕷科(Dioscoreaceae)植物署蕷(Dioscorea opposite Thunb)的塊莖，為常用中藥，它既可以與其它藥物配用，也是很好的補(bǔ)益食品。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，山藥具有“主治傷中、補(bǔ)虛贏、除寒熱邪氣，補(bǔ)中益氣力，長(zhǎng)肌肉，止泄痢，化痰涎，潤(rùn)皮毛，益腎氣。久服耳聰目明，經(jīng)身不饑延年”等功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山藥含有皂苷、粘液質(zhì)、膽堿、淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、尿囊素、多種氨基酸、維生素、多巴胺和多種礦物質(zhì)元素，能誘生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善冠狀動(dòng)脈及微循環(huán)的血流，還具有抗衰老、抗氧化、提高應(yīng)激力、降血脂、抗腫瘤等功效，是極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)良食品[1-2]。

黃酮類(lèi)化合物是山藥的主要活性成分之一，具有多種生物活性，如心血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗氧化自由基活性，抗炎、鎮(zhèn)痛活性，保肝活性，此外，大量研究表明黃酮類(lèi)化合物還具有降壓、降血脂、抗衰老、提高機(jī)體免疫力、瀉下、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙及抗變態(tài)等藥理活性[3]。

雙水相萃取(aqueous two-phase extraction，ATPE)技術(shù)始于20 世紀(jì) 60 年代，是利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行萃取的一種新型分離技術(shù)[4-5]。因該方法分離條件溫和、過(guò)程易放大、生物親和性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[5]。常用的分相鹽主要有(NH4)2SO4、NaNO3、Na2CO3、Na3PO4、Na2SO4、K2HPO4、NaAc或NaCl等，常用的有機(jī)相有甲醇、乙醇、丙醇、聚乙二醇(PEG)等。采用此方法提取山藥總黃酮，并研究不同雙水相提取黃酮類(lèi)化合物的效果，為山藥的開(kāi)發(fā)利用和發(fā)展先進(jìn)提取分離技術(shù)提供了有益的啟示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

磷酸氫二鉀:AR，硫酸銨:AR,碳酸鈉:AR，西安化學(xué)試劑廠(chǎng)；氯化鈉:AR,硫酸鈉:AR,天津市紅巖化學(xué)試劑廠(chǎng)；氫氧化鈉:AR,亞硝酸鈉:AR,成都科龍化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁:AR,甲醇:AR,聚乙二醇:AR，相對(duì)分子質(zhì)量3 000，北京化學(xué)試劑廠(chǎng)；乙醇:AR,天津化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:西安化學(xué)試劑廠(chǎng)；山藥:購(gòu)自渭南市臨渭區(qū)。

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?！憧茖W(xué)儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；T6新銳-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 總黃酮的提取

取新鮮山藥洗凈、去皮、切片、低溫烘干、粉碎備用。

1.2.1 乙醇-鹽雙水相提取[6]

取5個(gè)小錐形瓶分別加入12 mL水和18 mL無(wú)水乙醇使其形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，然后分別加入一定量磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉固體，邊加邊震蕩使固體溶解，溶液為無(wú)色透明液體，直至產(chǎn)生分相為止。再分別加入1 g山藥粉于各雙水相中，60 ℃恒溫水浴提取2 h，抽濾除去山藥渣，濾液于分液漏斗中靜置分層，取上層清液，用分光光度法測(cè)定ρ(總黃酮)。

1.2.2 聚乙二醇-鹽雙水相提取[7]

取5個(gè)小錐形瓶，分別加入25 mL水及3 g聚乙二醇，搖勻，再分別加入4 g硫酸銨、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸鈉和9 g氯化鈉(因?yàn)榧尤? g氯化鈉才分相)，振蕩使固體溶解，靜置，直至產(chǎn)生分相，再分別加入1 g山藥粉，60 ℃恒溫浴提取2 h，抽濾除去山藥渣，濾液于分液漏斗中靜置分層，取上層液，用分光光度法測(cè)ρ(總黃酮)。

1.2.3 甲醇-鹽雙水相提取

取5個(gè)小錐形瓶分別加入12 mL水和1 g硫酸銨、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸鈉、氯化鈉固體，然后加入18 mL甲醇，搖勻，靜置分層，再分別加入1 g山藥粉，60 ℃恒溫水浴提取2 h，抽濾除去山藥渣，濾液于分液漏斗中靜置分層，取上層液，用分光光度法測(cè)ρ(總黃酮)。

1.3 ρ(總黃酮)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

對(duì)照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品0.006 0 g，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液將蘆丁溶解，定容到100 mL容量瓶中，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：準(zhǔn)確吸取0.06 mg/mL 蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL，分別置于50 mL 容量瓶中，各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的 NaOH 溶液10 mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min。按照分光光度法在510 nm 波長(zhǎng)處，以試劑空白作參比測(cè)定吸光度，根據(jù)測(cè)定的不同質(zhì)量濃度蘆丁對(duì)照品溶液的吸光度，繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，得回歸方程。

提取物中ρ(黃酮)以ρ(總黃酮)計(jì)算，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，參照繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法，在總黃酮提取液中加入Al(NO3)3溶液，使黃酮化合物與鋁鹽形成穩(wěn)定的有色絡(luò)合物，在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算ρ(總黃酮)。準(zhǔn)確吸取上層提取液2.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，對(duì)照組加入蒸餾水2.0 mL，依次各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液10 mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min。按照分光光度法在510 nm波長(zhǎng)處，以試劑空白作參比測(cè)定吸光度。通過(guò)回歸方程計(jì)算出ρ(總黃酮)。總黃酮提取率按下式計(jì)算。

提取率=總黃酮質(zhì)量/樣品質(zhì)量[9]

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以蘆丁對(duì)照品的ρ(蘆丁)為橫坐標(biāo)，以在510 nm下測(cè)得不同的ρ(蘆丁)對(duì)照品的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。

ρ(蘆丁)/(mg·L-1)圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

對(duì)圖1的數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸得蘆丁對(duì)照品吸光度(A)和濃度(ρ)的方程為：A=0.013 3ρ-0.002 6，R2=1.000 0，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 各雙水相提取山藥ρ(總黃酮)

各雙水相提取山藥ρ(總黃酮)見(jiàn)表1～表3。

表1 乙醇-鹽雙水相提取的ρ(總黃酮)

表2 甲醇-鹽雙水相提取的ρ(總黃酮)

表3聚乙二醇-鹽雙水相提取的ρ(總黃酮)

鹽 K2HPO4Na2CO3(NH3)2SO4NaCl Na2SO4吸光度9.92188.40967.66627.00344.9144ρ(總黃酮) /(mg·mL-1)0.74620.63250.57660.52680.3697 提取率/%3.73103.16252.88302.63401.8485

由表1、表2、表3可知堿式或酸式鹽形成的雙水相提取效果比中性鹽的提取效果要好?？赡苁且?yàn)閴A式或酸式鹽可水解，與水的結(jié)合能力較強(qiáng)，且磷酸氫二鉀、碳酸鈉和硫酸銨在60 ℃時(shí)的實(shí)際溶解度也比后2種鹽大，從而使兩相分離的較為明顯，提取效果較好。而在前3種鹽中，磷酸氫二鉀在60 ℃的溶解度最大，同時(shí)磷酸氫二鉀是高價(jià)鹽其鹽析作用較強(qiáng)，提取效果更好一些。

由表1、表2、表3對(duì)比可知，聚合物形成的雙水相比低分子有機(jī)化合物形成的雙水相提取效果較好?？赡苁且?yàn)榈头肿佑袡C(jī)化合物如甲醇、乙醇，與水的親和能力較強(qiáng)，而不易形成雙水相，且在低溫加熱時(shí)甲醇、乙醇易揮發(fā)，從而導(dǎo)致提取效果不太好。用高聚物如聚乙二醇形成雙水相，可避免上述缺點(diǎn)，而且操作方便。

由以上分析可知山藥中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，用聚乙二醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取山藥總黃酮效果最好，測(cè)得樣品中ρ(總黃酮) =0.746 2 mg/mL，提取率為3.731 0%。

3 結(jié) 論

研究了常用的幾種雙水相提取山藥總黃酮的提取效果，其中在60 ℃時(shí)用聚乙二醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取山藥總黃酮效果最好，測(cè)得樣品中ρ(總黃酮)=0.746 2 mg/mL，提取率為3.731 0%。

雙水相萃取技術(shù)在微生物、有機(jī)化合物的分離和純化等過(guò)程中表現(xiàn)出相當(dāng)好的性能。其和傳統(tǒng)的分離方法(如回流法、鹽析、沉淀、有機(jī)溶劑萃取等)相比其優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、溶劑用量少、幾乎不存在有機(jī)溶劑殘留、分相時(shí)間短、分離條件溫和、萃取時(shí)間短，還避免了超聲波、微波等對(duì)人體的傷害，并有望用于大規(guī)模提取和純化生物活性物質(zhì)，因此有很好的應(yīng)用前景。但仍有一些未能解決的問(wèn)題，例如雙水相的形成機(jī)理和活性物質(zhì)在兩相體系間的分配機(jī)理尚未完全研究清楚，因此還需對(duì)該技術(shù)投入大量的研究。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

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