日本鰻鱺COX-2基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

張芳芳，熊 靜，2，段明珠，李春艷，彭喜霞，黃文樹(shù)，2，3

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門(mén) 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門(mén) 361021；3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門(mén) 361021）

日本鰻鱺COX-2基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

張芳芳1，熊 靜1，2，段明珠1，李春艷1，彭喜霞1，黃文樹(shù)1，2，3

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門(mén) 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門(mén) 361021；3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門(mén) 361021）

應(yīng)用PCR及RACE技術(shù)從日本鰻鱺（Anguillajaponica）中克隆獲得一個(gè)2463 bp環(huán)氧化酶基因（Cyclooxygenase-2，AjCOX-2）的cDNA序列.AjCOX-2前體為606肽，含有脊椎動(dòng)物COX-2的保守結(jié)構(gòu)域，以及加氧酶和過(guò)氧化物酶的活性位點(diǎn).在正常生理?xiàng)l件下，AjCOX-2基因在日本鰻鱺的鰓、鰾和皮膚中高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá).脂多糖刺激后8 h，AjCOX-2基因在皮膚和鰾中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0．05）；多聚胞苷酸刺激后8 h，AjCOX-2在皮膚、鰾和鰓中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0．05）；遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiellatarda）刺激后8 h，AjCOX-2在鰾中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也極顯著上調(diào)（P＜0．01）．結(jié)果表明，AjCOX-2基因是對(duì)外來(lái)病原刺激的早期響應(yīng)基因，參與機(jī)體抵抗外來(lái)刺激物的先天免疫應(yīng)答.

日本鰻鱺；COX-2；脂多糖；多聚胞苷酸；遲緩愛(ài)德華氏菌

0 引言

環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase，COX）也稱(chēng)為前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物G／H合成酶（Peroxide G／H synthetase）（EC 1.14.99.1），具有催化花生四烯酸形成前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物G2（Prostaglandin endoperoxides G2，PGG2）的雙加氧酶（或環(huán)氧合酶）活性，以及還原PGG2形成PGH2（Prostaglandin endoperoxides H2，PGH2）的過(guò)氧化物酶活性［1］.PGH2是前列腺素（prostaglandins）、環(huán)前列腺素（prostacyclins）及血栓烷（thromboxanes）的前體.前列腺素類(lèi)物質(zhì)在發(fā)熱、炎癥反應(yīng)、維持妊娠、調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸、水平衡和止血等多種生物過(guò)程中起重要作用［2］.

COX屬于血紅素依賴(lài)的髓過(guò)氧化物酶超家族，普遍存在于動(dòng)物、單細(xì)胞生物和微生物中.此外，在植物和真菌中也發(fā)現(xiàn)了COX類(lèi)似物，分別是病原誘導(dǎo)的加氧酶和亞油酸酯二醇合成酶［3］.已有研究表明，COX存在三種同工酶，即：COX-1、COX-2和COX-3.COX-3亦稱(chēng)為COX-1B或COX-1變體（COX-1V），是COX-1的可變剪切體［4］.哺乳類(lèi)COX-1和COX-2的氨基酸序列的一致性約為60%，其三級(jí)結(jié)構(gòu)相似［2］，但表達(dá)模式不同［5］.COX-1在多種組織／細(xì)胞中是組成型表達(dá)，以維持細(xì)胞的正常功能；而COX-2是組織特異性表達(dá)，并受炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和滲透力等誘導(dǎo)而上調(diào)［6］.

在硬骨魚(yú)類(lèi)中，COX同源物已從虹鱒（Oncorhynchusmykiss）［7］、金魚(yú)（Carassiusauratus）［8］、斑馬魚(yú)（Daniorerio）［2］、青鳉（Oryziaslatipes）［9］、美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinusfontinalis）［10］、塞內(nèi)加爾鰨（Soleasenegalensis）［11］、波紋絨須石首魚(yú)（Micropogoniasundulatus）［12］及狼鱸（DicentrarchuslabraxL）［13］等中得到克隆鑒定，并參與多種生物學(xué)過(guò)程.LPS、重組IL-1β和鰻弧菌（Vibrioanguillarum）可誘導(dǎo)狼鱸的頭腎白細(xì)胞中的COX-2基因上調(diào)轉(zhuǎn)錄表達(dá)［13］；LPS、重組IL-1β和天蠶抗菌肽B可上調(diào)虹鱒COX-2a在性腺細(xì)胞RTG-2中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［7］，表明COX-2參與炎癥反應(yīng).此外，在佛波酯PMA（phorbol-12-myristate-13-acetate）／A23187作用下，美洲紅點(diǎn)鮭COX-2在皮膚中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著上調(diào)［10］.而PMA／A23187誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)合成前列腺素PGF及PGE，后者參與排卵的生理過(guò)程［11］，因而認(rèn)為PMA／A23187可通過(guò)誘導(dǎo)COX-2上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)類(lèi)固醇的合成，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和排卵［13］.海水養(yǎng)殖的底鳉（Fundulusheteroclitus）鰓中COX-2的表達(dá)量比淡水養(yǎng)殖時(shí)高出3倍，并且在淡水—海水和海水—淡水急性轉(zhuǎn)移時(shí)COX-2的表達(dá)量迅速發(fā)生改變，表明COX-2可調(diào)節(jié)氯化鈉分泌［14］.在二惡英的誘導(dǎo)下，斑馬魚(yú)腦中COX-2的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)了血栓素形成，導(dǎo)致中腦的靜脈循環(huán)衰竭［15］.

鰻鱺（Anguillaspp）是世界主要水產(chǎn)養(yǎng)殖種類(lèi)之一，也是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，近十年來(lái)，鰻鱺養(yǎng)殖發(fā)展迅速，根據(jù)《2014年中國(guó)漁業(yè)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2013年中國(guó)鰻鱺產(chǎn)量達(dá)到2.06×105t，有著巨大的經(jīng)濟(jì)效益.然而，目前對(duì)其免疫反應(yīng)機(jī)理的研究仍然匱乏，因此，期望通過(guò)研究中國(guó)主要養(yǎng)殖種類(lèi)日本鰻鱺（Anguillajaponica）的COX-2基因及其表達(dá)規(guī)律，揭示其在免疫過(guò)程中的作用，這對(duì)于深入了解魚(yú)類(lèi)抗病機(jī)制，對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)病害防治的免疫學(xué)基礎(chǔ)具有十分重要的意義.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品的采集

日本鰻鱺體重（200±53）g，購(gòu)自福建省廈門(mén)市集美大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖水溫（28±2）℃、溶解氧（6.27±0.23）mg／L、亞硝酸鹽氮（1.60±0.39）mg／L及氨氮（17.99±7.82）mg／L.遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiellatarda）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

用含丁香酚的冰水麻醉日本鰻鱺后，斷尾，采集血液于經(jīng)肝素鈉預(yù)處理過(guò)的離心管中，混勻，2919 r／min離心20 min，收集下層細(xì)胞；隨后，解剖鰻鱺，采集肝臟、腸、皮膚、胃、頭腎、中腎、鰾、脾臟和鰓等組織／器官，分別于液氮中冷凍.保存于-80℃.

免疫原刺激試驗(yàn)采用腹腔注射法.實(shí)驗(yàn)分為：脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激組（Sig-ma，美國(guó)，貨號(hào)：L2880），注射劑量0.1 g／kg；多聚胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I∶C）刺激組（Sigma，美國(guó)，貨號(hào)：GE27-4732-01），注射劑量0.1 g／kg；遲緩愛(ài)德華氏菌刺激組，注射劑量為105cfu／g；陰性對(duì)照組為磷酸鹽緩沖液（PBS）.注射后分別于8，16，24，72 h采樣，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各采集日本鰻鱺6尾.

1.2AjCOX-2基因克隆

RNA提取：加1 mL Trizol試劑（Invitrogen，美國(guó)）和5顆直徑3 mm玻璃微珠至約100 mg日本鰻鱺各組織樣品中，勻漿（3000 r／min，20 s，Retsch MS100（日本））后，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)（Invitrogen，美國(guó)）提取總RNA.用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA的完整性，用分光光度計(jì)（Thermo，NanoDrop 2000，美國(guó)）檢測(cè)總RNA的濃度及純度.

RACE擴(kuò)增及全長(zhǎng)cDNA序列驗(yàn)證：取日本鰻鱺脾臟總RNA（約2μg）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit，Clonetech，美國(guó)），制備RACE模板.根據(jù)日本鰻鱺脾臟cDNA文庫(kù)中COX-2的EST序列，用Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（見(jiàn)表1），進(jìn)行RACE（SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit，Clonetech）和巢式PCR擴(kuò)增，獲得日本鰻鱺COX-2（AnguillajaponicaCOX-2，簡(jiǎn)稱(chēng)AjCOX-2）cDNA的3′和5′末端序列.根據(jù)5′RACE和3′RACE序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證Aj-COX-2全長(zhǎng)cDNA序列.PCR產(chǎn)物純化、回收和測(cè)序等參照文獻(xiàn)［16］的方法.

1.3 定量PCR

根據(jù)AjCOX-2 cDNA序列與AjCOX-2基因組序列（未發(fā)表數(shù)據(jù)），設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子區(qū)域引物（qAj-COX-2F和qAjCOX-2R，見(jiàn)表1），用Light Cycler?480 SYBR Green I試劑盒（Roche，德國(guó)）在LightCycler 480 IIRealtime PCR儀（Roche，德國(guó)）上進(jìn)行AjCOX-2基因表達(dá)量分析，同時(shí)，以β-actin作為內(nèi)參基因.每塊96孔PCR反應(yīng)板設(shè)有系列已知拷貝數(shù)的含AjCOX-2或內(nèi)參基因的質(zhì)粒樣品，與cDNA樣品一起擴(kuò)增，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率.取4μg總RNA，用GoScripTMReverse Transcription System（Promega，美國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用TE buffer稀釋?zhuān)琿PCR反應(yīng)體系及相關(guān)參數(shù)參考文獻(xiàn)［16］，并繪制產(chǎn)物的熔解曲線以驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性.

表1 引物序列Tab.1 List o f prime r sequences

數(shù)據(jù)處理：以β-actin表達(dá)量為基準(zhǔn)，對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理.不同組織／器官的AjCOX-2基因表達(dá)水平是以標(biāo)準(zhǔn)化樣品中靶基因的絕對(duì)表達(dá)量乘以1000來(lái)表示.免疫源刺激后基因的表達(dá)水平研究，是以同一時(shí)間點(diǎn)刺激組樣品中靶基因的絕對(duì)表達(dá)量除以生理對(duì)照組樣品中靶基因的絕對(duì)表達(dá)量來(lái)表示.

1.4 序列生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）進(jìn)行序列基礎(chǔ)分析.利用ExPASy工具（http：／／web.expasy.org／translate／）翻譯氨基酸序列；SignalP 4.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）分析信號(hào)肽；NetPhos Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos）分析糖基化位點(diǎn)；PROSITE（http：／／us.expasy.org／tools／scanprosite）分析蛋白質(zhì)的功能域；SIAS（http：／／imed.med.ucm.es／Tools／sias.htm l）比較氨基酸序列一致性及同源性；使用MEGA 5.0軟件的鄰接法（N-J法）構(gòu)建基于氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).氨基酸序列數(shù)據(jù)源于Ensembl網(wǎng)站（http：／／asia.ensembl.org／index.html）.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果使用Excel軟件計(jì)算，采用單因素變量方差分析法（ANOVA）分析免疫原刺激樣品間AjCOX-2表達(dá)量差異，利用Dunnett t-Test（2-sided）進(jìn)行多重比對(duì).所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）的方式表示，P＜0．05表示差異顯著，P＜0．01表示差異極顯著.利用GraphPad Prism v5.0軟件作圖.

2 結(jié)果

2.1AjCOX-2基因的序列分析

根據(jù)AjCOX-2的EST序列，進(jìn)行RACE和巢式PCR擴(kuò)增，獲得5′RACE產(chǎn)物906 bp、3′RACE產(chǎn)物1801 bp及中間產(chǎn)物443 bp，經(jīng)序列拼接后得到AjCOX-2的全長(zhǎng)cDNA序列，并用引物AjCOX-2 fl-F和AjCOX-2 fl-R驗(yàn)證其開(kāi)放閱讀框.結(jié)果顯示：AjCOX-2 cDNA全長(zhǎng)2463 bp，GenBank登錄號(hào)為KP888157，其中5′UTR為120 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?821 bp編碼一個(gè)607肽，3′UTR為523 bp.3′UTR中包含保守的終止信號(hào)（AATAAA）、PolyA序列，及6個(gè)與RNA不穩(wěn)定性相關(guān)的ATTTA位點(diǎn).生物信息學(xué)分析結(jié)果：AjCOX-2前體肽相對(duì)分子質(zhì)量為69 320，pI為7.06，N-末端21個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽（見(jiàn)圖1）.此外，還含有脊椎動(dòng)物COX-2前體肽保守的12個(gè)半胱氨酸殘基（其中C25—C36、C26—C149、C30—C46、C48—C58和C559—C566分別形成五對(duì)二硫鍵）、3個(gè)環(huán)氧化酶活性位點(diǎn)（Y375，H378和S520）、2個(gè)過(guò)氧化物酶活性位點(diǎn)（Q203和H207）、4個(gè)糖基化位點(diǎn)（N-57、-134、-406、-585）、2個(gè)血紅素結(jié)合域（212-KALGH-216和291-WLREHNRVCD-304），以及C-端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)（604-TSEL-607）（見(jiàn)圖1）.

2.2AjCOX-2基因的氨基酸序列多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

選取哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)和硬骨魚(yú)類(lèi)代表物種COX-2同源物與本研究AjCOX-2的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì).結(jié)果顯示，AjCOX-2與其他物種COX-2的氨基酸序列一致性和相似性分別為0.678～0.777及0.7781～0.8515，其中與美洲紅點(diǎn)鮭COX-2a的一致性和相似性均最高，有趣的是，與其一致性最低的是兩棲類(lèi)爪蟾，而與其相似性最低的卻是人類(lèi)（見(jiàn)表2）.脊椎動(dòng)物COX-2前體肽都含有信號(hào)肽序列，其中高等脊椎動(dòng)物（兩棲類(lèi)、雞以及哺乳動(dòng)物）的信號(hào)肽長(zhǎng)度小于20個(gè)氨基酸殘基，而硬骨魚(yú)均大于20.在脊椎動(dòng)物COX-2蛋白質(zhì)序列中含有1到多個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中糖基化位點(diǎn)N-53（相對(duì)于人類(lèi)COX-2氨基酸的位置）普遍存在于所選的物種中.

多數(shù)硬骨魚(yú)的COX-2有兩個(gè)亞型，即COX-2a和COX-2b，選取的代表性的硬骨魚(yú)類(lèi)COX-2a和COX-2b進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示，COX-2a和COX-2b的蛋白質(zhì)都含有6個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，從N-末端至C-末端分別為信號(hào)肽、二聚化作用結(jié)構(gòu)域1、膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域、二聚化作用結(jié)構(gòu)域2、催化作用域，以及C-端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)［17］.二聚化作用結(jié)構(gòu)域1中的7個(gè)半胱氨酸殘基位置高度保守，預(yù)測(cè)可形成3對(duì)二硫鍵（C21—C31、C26—C41、C43—C52），另一個(gè)半胱氨酸（C22）與催化作用域中的一個(gè)半胱氨酸（C145）形成二硫鍵（見(jiàn)圖2）.在催化作用域內(nèi)，存在3個(gè)環(huán)氧化酶的活性位點(diǎn)（Y375，H378，S520）、2個(gè)過(guò)氧化物酶活性位點(diǎn)（Q203和H207）及2個(gè)血紅素結(jié)合域.此外，COX-2a和COX-2b前體肽分子的不同之處：COX-2a前體肽中第一個(gè)血紅素結(jié)合域?yàn)椤癤XLGH”，而在COX-2b中為“XGXXH”；COX-2a中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)為“S（S／T）EL”，而在COX-2b中則為“T（S／T）EL”.

用MEAG 5.0軟件的N-J法對(duì)上述16條COX-2全長(zhǎng)氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖3所示，以人類(lèi)COX-1全長(zhǎng)氨基酸序列作為外參比.結(jié)果顯示，在COX-2支中，兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)聚為一小支，魚(yú)類(lèi)聚為另一小支，其中COX-2a聚為一簇，COX-2b聚為另一簇，AjCOX-2與硬骨魚(yú)的COX-2a聚在一簇.結(jié)果表明，COX-2的蛋白質(zhì)符合傳統(tǒng)的進(jìn)化模式，進(jìn)化樹(shù)與物種之間的進(jìn)化關(guān)系基本對(duì)應(yīng).

表2AjCOX-2與代表性脊椎動(dòng)物的COX-2基因編碼蛋白的比對(duì)Fig．2 Between pro teins encoded byAjCOX-2 andCOX-2 gene in rep resentative vertebrates

圖2 A jCOX-2與其他代表物種的COX-2基因的氨基酸序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple a lignmentof AjCOX-2 with COX-2s from some representative species

圖3 COX-2s的NJ統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis ofCOX-2s in vertebrate using neighbor joiningmethod

2.3AjCOX-2在正常養(yǎng)殖的日本鰻鱺中不同組織／器官的表達(dá)

用引物qAjCOX-2F和qAjCOX-2R擴(kuò)增日本鰻鱺cDNA得到長(zhǎng)度為346 bp片段，產(chǎn)物的熔解曲線呈單一對(duì)稱(chēng)的峰圖，說(shuō)明無(wú)特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增效率為1.857～1.915，同時(shí)以日本鰻鱺基因組為模板，無(wú)法獲得有效擴(kuò)增.以引物β-actinF和β-actinR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為178 bp的β-actin片段，其產(chǎn)物的熔解曲線也呈單一對(duì)稱(chēng)的峰圖，擴(kuò)增效率為1.903～1.927.

利用上述建立的qPCR檢測(cè)方法，分別單獨(dú)檢測(cè)了6尾正常養(yǎng)殖日本鰻鱺的鰓、鰾、皮膚、腎臟、脾臟、心臟、腸、胃、性腺、肝及血液等12個(gè)組織／器官中AjCOX-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，結(jié)果顯示，AjCOX-2 mRNA在所檢測(cè)組織／器官中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（見(jiàn)圖4），其中表達(dá)量較高的依次為鰓、鰾和皮膚，顯著高于其他各組織器官（P＜0.05），但是，該三者間差異不顯著（P＞0.05）；其次是腎臟（頭腎和中腎）、心臟、脾臟和腸，其表達(dá)量顯著高于其他被檢測(cè)樣品（性腺、血細(xì)胞、胃和肝）（P＜0.05）.

圖4 AjCOX-2在日本鰻鱺多組織中的表達(dá)譜Fig.4 Expression pro file of AjCOX-2 in multiple tissues of Anguilla japonica

2.4 LPS、E.tarda及Poly I∶C刺激后AjCOX-2基因表達(dá)變化

AjCOX-2在日本鰻鱺不同組織／器官中不同程度地表達(dá)，并且在鰓、鰾及皮膚中大量表達(dá).因此，本文進(jìn)一步檢測(cè)了LPS、Poly I∶C、E.tarda活體刺激后，該基因在鰓、鰾和皮膚中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示：

1）LPS刺激.在皮膚中，LPS刺激后，短期內(nèi)（8 h）AjCOX-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量極顯著升高，是對(duì)照組的7.3倍（P＜0．01），至16 h已下降，但是仍顯著高于對(duì)照組（P＜0．05）（見(jiàn)圖5a）；在鰾中，LPS刺激后8 h，AjCOX-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)也顯著上調(diào)（P＜0．05）（見(jiàn)圖5b）；然而，在鰓中，受LPS刺激后，前72 h，AjCOX-2的表達(dá)量不但沒(méi)有上調(diào)反而顯著下調(diào)，顯著低于對(duì)照組（P＜0．05）.

2）E.tarda人工感染.不同于LPS刺激結(jié)果，遲緩愛(ài)德華氏菌刺激后，皮膚中AjCOX-2基因的表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0．05）.在鰾中，刺激后8 h，AjCOX-2的表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），是對(duì)照組的6.08倍；16 h時(shí)，無(wú)顯著差異；而在24 h和72 h時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但是上升的幅度不大，分別為2.31和2.19倍.在鰓中，刺激后8 h無(wú)顯著變化；在16 h時(shí)，AjCOX-2的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0．01）；24 h時(shí)，不顯著下降；而在72 h時(shí)卻極顯著下調(diào)（P＜0．001），僅為對(duì)照組的0.43倍（見(jiàn)圖5b）.

3）Poly I∶C刺激.在刺激后8 h時(shí)，AjCOX-2在鰓、皮膚及鰾中均顯著或極顯著上調(diào)（P＜0.05）；在刺激后16 h時(shí)，在鰓和皮膚中AjCOX-2的表達(dá)仍呈極顯著（P＜0．01）和顯著（P＜0．05）上調(diào)，隨后下降；在刺激后72 h，AjCOX-2在鰓中的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0．001）（見(jiàn)圖5c）.

圖5 AjCOX-2受LPS、E.tarda和Poly I:C誘導(dǎo)表達(dá)模式Fig.5 Modulation ofexp ression of AjCOX-2 in skin,swim bladderand gillafter intraperitonea linjection with LPS,E.tarda and Poly I:C

3 討論

COX-2是一種具有環(huán)氧化酶和過(guò)氧化酶活性的酶，參與發(fā)熱、維持妊娠、調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸、炎癥反應(yīng)、水平衡和止血等多種生物過(guò)程［2］.本研究克隆了日本鰻鱺的COX-2（AjCOX-2）全長(zhǎng)cDNA序列，解析其分子特征并研究了其表達(dá)模式.

3.1AjCOX-2屬于硬骨魚(yú)COX-2a基因

哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和兩棲類(lèi)等高等脊椎動(dòng)物體內(nèi)僅存在一個(gè)COX-2基因，而在低等脊椎動(dòng)物如硬骨魚(yú)中，可能由于進(jìn)化過(guò)程中選擇性染色體區(qū)域的疊加作用，出現(xiàn)兩個(gè)COX-2基因，即COX-2a與COX-2b［7］.系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，本研究的AjCOX-2與其他硬骨魚(yú)的COX-2a聚在同一簇，支持率為100%；氨基酸序列多重比對(duì)的結(jié)果也支持AjCOX-2應(yīng)歸屬于COX-2a，其與美洲紅點(diǎn)鮭COX-2a及虹鱒COX-2a的一致性及相似性都最高；此外，AjCOX-2的第一個(gè)血紅素結(jié)合域和C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)分別為KALGH與TSEL，符合硬骨魚(yú)COX-2a的“XXLGH”與“S（S／T）EL”，而明顯不同于COX-2b的基序.綜上，AjCOX-2應(yīng)屬于硬骨魚(yú)COX-2a.

3.2AjCOX-2基因的表達(dá)具有組織特異性

硬骨魚(yú)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有組織特異性.在正常養(yǎng)殖的日本鰻鱺中，AjCOX-2主要在鰓中高水平表達(dá)，該結(jié)果與其他硬骨魚(yú)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果基本一致.比如，在塞內(nèi)加爾鰨，COX-2在睪丸、輸卵管和鰓中高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)［11］；底鳉COX-2在鰓和腎臟中大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)［14］；斑馬魚(yú)COX-2a在鰓、腸及睪丸中的高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，而COX-2b在鰓，心臟和卵巢中大量表達(dá)［2］.此外，有研究報(bào)道，COX-2在硬骨魚(yú)的卵巢／睪丸中高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)［2，10-11］.而本研究AjCOX-2在性腺中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量較低，原因可能是，前人報(bào)道的性腺高水平表達(dá)的魚(yú)類(lèi)皆為性成熟的成魚(yú)［18-20］，而本研究中所選擇的日本鰻鱺雖然達(dá)到商品規(guī)格，但其性腺遠(yuǎn)未成熟.然而，AjCOX-2在性腺表達(dá)量水平較低是否真與鰻鱺的性腺不成熟有關(guān)，有待進(jìn)一步研究.此外，本研究發(fā)現(xiàn)AjCOX-2在鰾和皮膚中高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)，然而，有關(guān)COX-2基因在硬骨魚(yú)的鰾中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究報(bào)道甚少，因此，本研究發(fā)現(xiàn)的COX-2基因在魚(yú)類(lèi)鰾中高水平表達(dá)的現(xiàn)象，是日本鰻鱺特有，還是普遍存在于其他硬骨魚(yú)中，有待進(jìn)一步研究確認(rèn).

此外，本文還發(fā)現(xiàn)COX-2基因在日本鰻鱺的玻璃鰻階段具有極高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，其表達(dá)量甚至是本研究日本鰻鱺黑仔鰻的鰓（轉(zhuǎn)錄水平最高的器官）的1.5倍（未發(fā)表數(shù)據(jù)）.分析原因，可能與玻璃鰻是從半咸水的河口中捕撈到的有關(guān).有研究發(fā)現(xiàn)海水養(yǎng)殖的鳉COX-2在鰓中的表達(dá)量比淡水養(yǎng)殖時(shí)高出了3倍，并且在淡水—海水和海水—淡水急性轉(zhuǎn)移中會(huì)快速短暫地改變COX-2的表達(dá)量［14］.AjCOX-2是否參與氯化鈉的調(diào)節(jié)，及其調(diào)控模式有待進(jìn)一步研究.

3.3 外源刺激物調(diào)節(jié)AjCOX-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

有研究發(fā)現(xiàn)，受LPS刺激后6 h，金魚(yú)頭腎細(xì)胞中COX-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平極顯著上調(diào)；受LPS刺激后6 h虹鱒COX-2a在性腺細(xì)胞RTG-2中的mRNA表達(dá)也顯著上調(diào)［7］；在LPS和重組IL-1β誘導(dǎo)后24 h狼鱸COX-2在其頭腎白細(xì)胞mRNA中的表達(dá)上調(diào)并達(dá)到最大值［13］；在鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染后2周，COX-2基因在狼鱸的頭腎白細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)到了最大值，誘導(dǎo)后3周表達(dá)量下調(diào)［13］.這些結(jié)果與本研究相似，LPS刺激后8 h，AjCOX-2在皮膚和鰾中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0．05）；Poly I∶C刺激后8 h，AjCOX-2在皮膚、鰾和鰓中均顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0．05）；E．tarda刺激后8 h，AjCOX-2在鰾中的表達(dá)也極顯著上調(diào)（P＜0．01）.本研究表明，AjCOX-2是對(duì)外來(lái)病原刺激的早期響應(yīng)基因，參與機(jī)體抗外來(lái)刺激物的先天免疫應(yīng)答.

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（責(zé)任編輯 朱雪蓮 英文審校 張子平）

M olecular Cloning，Characterization and Expression ofCOX-2 in Japanese eel，Anguillajaponica

ZHANG Fang-fang1，XIONG Jing1，2，DUANMing-zhu1，LIChun-yan1，PENG Xi-xia1，HUANGWen-shu1，2，3
（1.Fishery College，Jimei University，Xiamen 361021，China；2.Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry，Ministry of Education，Xiamen 361021，China；3.Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Vtiligation of Marine Biological Resources，Xiamen 361021，China）

In this study，a full-length cDNA forCyclooxygenase-2（AjCOX-2）was successfully cloned from the Japanese eel（Anguillajaponica）by PCR and RACE.The predicted protein ofAjCOX-2 is606 amino acids in length，which contained all the conservative structural domains and the active sites for both the peroxidase and cyclooxygenase as in its vertebrate homologues.In physiological condition，AjCOX-2 mRNA was highly expressed in gill，skin and swim bladder in Japanese eel.Additionally，a significant increasingAjCOX-2 mRNA was detected in both skin and swim bladder（P＜0．05）at 8 h afterinvivointraperitoneal challenged with LPS and Poly I∶C，whilst a significant up-regulation ofAjCOX-2 mRNA was found only in swim bladder at8 h after challenged byEdwardsiellatarda，a pathogenic bacterium isolated from Japanese eel.The results suggested thatAjCOX-2 might be an early immediate gene in response to the immune stimuli and involved in the innate immune response against the pathogens infection in Japanese eel.

Anguillajaponica；COX-2；LPS；Poly I∶C；Edwardsiellatarda

S 917

A

1007-7405（2015）05-0321-12

2015-05-14

2015-06-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172438）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J06008）；福建省科技項(xiàng)目（201311180002）；福建省教育廳項(xiàng)目（JA12195）

張芳芳（1990—），女，碩士，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方向研究，通信作者：黃文樹(shù)（1973—），男，副教授.E-mail：wshuang＠jmu.edu.cn.