海洋擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)果膠酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

吳 爽，張 敏，潘仁瑞，蔡敬民,

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036；2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，合肥230601）

海洋擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)果膠酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

吳 爽1，張 敏2，潘仁瑞2，蔡敬民1,2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036；2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，合肥230601）

通過超濾、DEAESephadex A-50離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過濾層析，對一株來自海洋的擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)所產(chǎn)果膠酶進(jìn)行分離純化，得到電泳純的果膠酶，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示單一條帶，且果膠酶亞基的分子質(zhì)量約為63.96 ku，純化倍數(shù)為24.13，回收率為36.32%。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該果膠酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值5.4，在pH值4.6～6.2比較穩(wěn)定，Mg2+、Ca2+對果膠酶活力有明顯激活作用，Cu2+有明顯抑制作用，以果膠粉為底物的Vmax為393.56μg/(m in·m L)，Km為3.34mg/m L。

海洋擴(kuò)展青霉；果膠酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

果膠酶(Pectinase)是指能夠分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱，包括聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等［1-2］。果膠酶廣泛應(yīng)用于果汁澄清、木材防腐、麻類脫膠、棉織物精練、天然藥物活性成分提取、飼料加工、茶葉發(fā)酵、環(huán)保等領(lǐng)域［3-7］。國外對果膠酶的研究始于20世紀(jì)30年代，在菌種選育、發(fā)酵優(yōu)化、純化等領(lǐng)域已經(jīng)取得了很多成果，中國從20世紀(jì)60年代開始研究果膠酶，目前生產(chǎn)的果膠酶純度不高，多數(shù)要依賴進(jìn)口，工業(yè)化生產(chǎn)落后于法國、德國、荷蘭、丹麥、意大利等果膠酶的主要生產(chǎn)國［2］，然而中國海域遼闊，微生物資源非常豐富，因此利用高產(chǎn)果膠酶的海洋微生物生產(chǎn)果膠酶，并探索高效的純化工藝，成為提高中國工業(yè)果膠酶品質(zhì)的重要途徑。

目前，果膠酶已被學(xué)者們廣泛研究，已發(fā)現(xiàn)許多霉菌和少量細(xì)菌以及酵母菌都可以產(chǎn)生果膠酶，國內(nèi)外科學(xué)家利用鹽析、層析、液相色譜、電泳等手段對果膠酶進(jìn)行純化，研究表明，果膠酶分子質(zhì)量一般在20 ku～60 ku之間，活性范圍在pH值3.0～9.0之間，大部分果膠酶的最適作用溫度在45℃左右［8-10］。

很多學(xué)者是從腐爛的果蔬或者果園泥土中篩選出產(chǎn)果膠酶的菌株［1,7,11］進(jìn)行研究，對于海洋來源的產(chǎn)果膠酶菌株的研究鮮有報(bào)道，本文從實(shí)驗(yàn)室保藏的一株來自海洋的擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)出發(fā)，對其所產(chǎn)果膠酶進(jìn)行分離純化，并對果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在探索出一條高效、低耗、簡捷的果膠酶純化新工藝。同時(shí)本文所利用的果膠酶生產(chǎn)菌來自海洋，為新型酶制劑的開發(fā)提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

菌株：擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)，分離自浙江蒼南海域的海水，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮7 g，果膠粉0.42 g，氯化銨0.28 g，人工海水［9］8.4m L，pH值自然，121℃滅菌20m in。

液態(tài)培養(yǎng)基：硝酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，氯化鉀0.05 g，硫酸亞鐵0.001 g，蔗糖3 g，瓊脂2 g，果膠粉1 g，蒸餾水100m L，加熱溶解，121℃滅菌20m in。

1.2主要試劑及儀器

牛血清白蛋白、DEAESephadex A-50、Sephadex G-100、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，上述試劑均購自Sigma公司。

752型紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器股份有限公司；自動(dòng)部分收集器：BSA-160型，上海滬西分析儀器廠；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3果膠酶活力測定

采用DNS法，參考文獻(xiàn)［13］作適當(dāng)修改。

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確配置1.5mg/m L的半乳糖醛酸溶液，取8支試管，分別加入0.1m L、0.2m L～0.8 m L的半乳糖醛酸溶液，分別用蒸餾水定容至1 m L，每個(gè)試管均加入3m L DNS溶液，沸水浴10m in，迅速冷卻，蒸餾水定容至20m L，540 nm波長處測定吸光值，以1m L蒸餾水作為空白對照。每管重復(fù)3次，取平均值，以半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，吸光值（D540nm）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。得到半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.85762 x-0.02689，相關(guān)系數(shù)R2=0.99873。

取0.2m L適當(dāng)稀釋的酶液于試管中，50℃水浴平衡5min，加入1.8m L水浴平衡過的0.4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30min后，加3m LDNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10m in，冷卻后蒸餾水定容到20m L，搖勻；以滅活的酶液做空白對照。在540 nm波長處測定吸光度。結(jié)合上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，在上述反應(yīng)體系中，以每毫升酶液1min降解果膠底物產(chǎn)生1μg半乳糖醛酸定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of galacturonic acid

1.4 蛋白含量的測定

按Bradford法［14］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5海洋擴(kuò)展青霉產(chǎn)果膠酶方式的確定

250m L三角瓶中裝50m L液態(tài)培養(yǎng)基，滅菌，冷卻，接種4m L孢子懸液（3×107個(gè)/m L），28℃恒溫培養(yǎng)3 d，將發(fā)酵液于4℃，10000 r/m in離心10m in，分別收集上清液和菌體。菌體用生理鹽水重懸，離心，反復(fù)清洗幾次后，懸浮于同發(fā)酵上清液等體積的生理鹽水中，加入溶菌酶，37℃水浴1 h［15］，使細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)含物擴(kuò)散出來，并于4℃，10000 r/m in離心10m in，取上清液，分別測定發(fā)酵上清液和細(xì)胞內(nèi)含物上清液的酶活力。

1.6 果膠酶的純化

1.6.1粗酶液的制備

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基并接種2m L(107個(gè)/ m L)孢子懸液，28℃條件下培養(yǎng)3 d取出，每瓶固態(tài)發(fā)酵酶曲中倒入50m L pH值5.4，0.04mol/LNa2HPO4～0.02 mol/L檸檬酸緩沖液，室溫浸提1 h，浸提液用6層紗布過濾，再經(jīng)4℃，10000 r/min離心10min，去除殘留的菌絲體及雜質(zhì)，上清液即為粗酶液。

1.6.2超濾

取粗酶液，分別使用截留分子質(zhì)量為100 ku和30 ku的超濾膜對上清液進(jìn)行超濾，取分子質(zhì)量在30 ku和100 ku之間的部分備用。

1.6.3DEAESephadex A-50離子交換層析

將上述所得酶液在 pH值 5.4，0.04 mol/L Na2HPO4～0.02 mol/L檸檬酸緩沖液中透析后，用PEG20000濃縮，再經(jīng)4℃，10000 r/m in離心10m in，取上清液，上樣于相同緩沖液平衡好的DEAE-Sephadex A50離子交換層析柱（1.6 cm×30 cm，床層體積50m L），用0～1mol/LNaCl和上述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速1m L/m in，每管5m L，收集有酶活力的蛋白峰［9］，超濾濃縮后備用。

1.6.4 Sephadex G-100凝膠過濾層析

上述所得酶液經(jīng)4℃，10000 r/min離心10min后，上清液上樣15m L于pH值5.4，0.04mol/L Na2HPO4～0.02mol/L檸檬酸緩沖液平衡后Sephadex G-100凝膠過濾層析柱（2.6 cm×100 cm）［16］，用同樣的緩沖液洗脫，流速為0.3m L/min，收集有酶活力的蛋白峰，透析濃縮。

1.7純度鑒定及分子量的測定

利用SDS-PAGE電泳［17］測定酶的分子量，濃縮膠3%，分離膠12%，起始電壓為200V，進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)整為150V，考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.8酶學(xué)性質(zhì)

1.8.1最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

果膠酶與底物在不同溫度（30℃、40℃、50℃、60℃和70℃）下反應(yīng)，測定酶活力，得最適反應(yīng)溫度；將果膠酶在不同溫度（30℃、40℃、50℃、60℃和70℃）下保溫120m in，每隔20m in測1次酶活力，研究果膠酶的溫度穩(wěn)定性。

1.8.2最適反應(yīng)pH值及穩(wěn)定性

果膠酶與不同pH值（3.0、3.8、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、7.0、7.8和8.6）的緩沖液所配制的果膠底物反應(yīng)，測定酶活力，得果膠酶的最適反應(yīng)pH值；將果膠酶用不同pH值（3.0、3.8,4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、7.0、7.8和8.6）的緩沖液處理2 h后，測定酶活力，研究果膠酶的pH穩(wěn)定性。

1.8.3不同金屬離子對果膠酶的影響

向酶反應(yīng)體系中分別加入不同金屬離子(Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Mn2+、K+)［18］，使其在體系中的濃度為2mmol/L，測定酶活力。

1.8.4果膠酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定

果膠酶分別與不同濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）的果膠底物在最適條件下反應(yīng)，測定酶活力，根據(jù)Lineweave-Burk雙倒數(shù)法作圖，利用公式1/V=1/V max+(K m/V max)·(1/〔S〕)，求出果膠酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)［19］。

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

使用Spss20.0中的LSD法進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1海洋擴(kuò)展青霉產(chǎn)果膠酶方式的確定

檢測到細(xì)胞內(nèi)含物上清液中酶活幾乎為0，發(fā)酵上清液有較高酶活力，說明該果膠酶為胞外酶。

圖2 果膠酶DEAE Sephadex A-50離子交換層析圖Fig 2 Elution profileof pectinaseon DEAESephadex A-50 column

2.2 DEAESephadex A-50離子交換層析如圖2所示，超濾后的酶液經(jīng)DEAESephadex A-50離子交換層析后，出現(xiàn)3個(gè)蛋白峰，檢測到第3個(gè)峰有酶活，前2個(gè)蛋白峰沒有酶活，為雜蛋白，離子交換層析是根據(jù)吸附力大小分離蛋白質(zhì)的，第1個(gè)峰處的雜蛋白吸附力最小，先被洗脫下來，果膠酶的吸附力大，最后被洗脫下來，前2個(gè)峰處的雜蛋白分子量可能比果膠酶分子量小，也可能比果膠酶分子量大。

2.3 Sephadex G-100凝膠過濾層析

圖3 果膠酶Sephadex G-100凝膠過濾層析圖Fig 3 Elution profileof pectinaseon Sephadex G-100 column

離子交換層析后，收集有酶活的第3個(gè)蛋白峰，經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析后，出現(xiàn)3個(gè)較明顯的蛋白峰，如圖3所示，檢測到第2個(gè)蛋白峰有酶活，為果膠酶所在的峰，另外2個(gè)蛋白峰沒有酶活，為雜蛋白，根據(jù)凝膠過濾層析的原理，大分子先被洗脫下來，小分子后被洗脫下來，說明第1個(gè)峰處的雜蛋白分子量大于果膠酶分子量，第3個(gè)峰處的雜蛋白分子量小于果膠酶分子量，且從圖2可以看出，雜蛋白含量明顯比果膠酶含量低。

2.4 果膠酶的純化結(jié)果

表1 果膠酶的提純結(jié)果Table1 Summary of purification of pectinase

由表1可知，經(jīng)3步純化后，果膠酶被提純了24.13倍，回收率為36.32%。

2.5 果膠酶分子量測定結(jié)果

如圖4所示，純化后的酶液經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示單一的條帶，說明純化后的果膠酶只有單一的亞基，酶液已達(dá)到電泳純，以Marker中各蛋白的相對遷移率Rf為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量的對數(shù)值lg M r為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線lg Mr=-1.8784Rf+2.6988（R2=0.9749），代入樣品的遷移率，計(jì)算得果膠酶亞基的分子質(zhì)量為63.96 ku，這與張名愛［12］的研究結(jié)果61.4 ku接近。

圖4 純化的果膠酶SDS-PAGEFig 4 SDS-PAGE pattern of purified pectinase

2.6果膠酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

如圖5所示，隨著溫度上升，果膠酶活力呈先上升后下降趨勢，當(dāng)溫度低于50℃或高于50℃時(shí)，酶活力顯著下降（P＜0.05），50℃酶活力最高，表明該海洋擴(kuò)展青霉所產(chǎn)果膠酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。

圖5 果膠酶的最適反應(yīng)溫度Fig 5 Theoptimum reaction temperatureof pectinase

圖6 果膠酶的溫度穩(wěn)定性Fig 6 The temperature stability of pectinase

由圖6可知，隨著保溫時(shí)間的延長，果膠酶活力逐漸下降，30℃保溫120m in，果膠酶活力下降不顯著，說明果膠酶在30℃，穩(wěn)定性好，40℃保溫80min后，酶活力開始顯著下降（P＜0.05），在50℃、60℃和70℃中，隨著保溫時(shí)間延長，酶活力顯著（P＜0.05）下降；50℃、60℃和70℃保溫，相同時(shí)間點(diǎn)酶活力呈下降趨勢，并且與30℃對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶活力相比，下降顯著（P＜0.05）；50℃保溫80min，酶活力保留率為52.58%，50℃保溫120m in，酶活保留率為44.60%；60℃保溫20m in，酶活保留率為54.81%，70℃保溫20 m in，酶活為初始的40.64%。60℃和70℃保溫120min后，酶活力保留率均在10%以下。

2.7果膠酶的最適pH值及穩(wěn)定性

如圖7所示，隨pH值上升，果膠酶活力先上升后下降，pH值小于5.0或大于5.8，酶活力顯著下降（P＜0.05），pH值5.4時(shí)酶活力最高，表明果膠酶最適反應(yīng)pH值5.4。

如圖7所示，pH值低于4.6或高于6.2，酶活力顯著下降（P＜0.05），pH值4.6～6.2范圍內(nèi)，酶活力基本穩(wěn)定，且顯著（P＜0.05）高于其他pH值的酶活力，表明果膠酶在pH值4.6～6.2范圍內(nèi)穩(wěn)定。

2.8金屬離子對果膠酶活力的影響

如表2所示，金屬離子對果膠酶活力促進(jìn)作用順序Mg2+＞Ca2+＞Na+＞Sr2+＞Co2+＞K+，對果膠酶活力抑制作用大小Cu2+＞Zn2+＞Fe2+，Mg2+、Ca2+對果膠酶有很強(qiáng)的激活作用，Mn2+對果膠酶活力幾乎無影響，Cu2+有對果膠酶有很強(qiáng)的抑制作用。

圖7 果膠酶的最適pH值及穩(wěn)定性Fig 7 Theoptimum reaction pH and pH stability of pectinase

表2 金屬離子對果膠酶活力的影響Table2 Effectofmetal ionson theactivity of pectinase

2.9 果膠酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

果膠酶分別與不同濃度的果膠底物（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）在最適條件下反應(yīng)，測定酶活力，根據(jù)Lineweave-Burk雙倒數(shù)法作圖8，利用公式:1/V=1/V max+(K m/V max)·(1/〔S〕)，求出果膠酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，當(dāng)以果膠為底物時(shí)，V max為393.56 μg/(min·m L)，K m為3.34mg/m L。

圖8 果膠酶的Lineweaver-Burk圖Fig 8 Lineweaver-Burk plotof pectinase

3 討論

對一株海洋擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)所產(chǎn)果膠酶進(jìn)行純化，經(jīng)超濾、DEAE Sephadex A-50離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過濾層析后，獲得電泳純的果膠酶，其亞基單一的分子質(zhì)量約為63.96 ku，純化倍數(shù)為24.13，回收率為36.32%，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，在30℃穩(wěn)定，40℃較穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH值5.4，在pH值4.6～6.2比較穩(wěn)定；對果膠酶活力促進(jìn)作用大小順序Mg2+＞Ca2+＞Na+＞Sr2+＞Co2+＞K+，Mn2+對果膠酶活力無影響，對果膠酶活力抑制作用大小Cu2+＞Zn2+＞Fe2+。Mg2+、Ca2+對果膠酶活力有很強(qiáng)激活作用，Cu2+有很強(qiáng)抑制作用，Mn2+幾乎不影響果膠酶活力；以果膠粉為底物的V max為393.56μg/(min·m L)，K m為3.34mg/m L。

許多學(xué)者對酶的純化，首先采用硫酸銨沉淀，此方法操作起來比較耗時(shí)，而且很容易因局部硫酸銨濃度過大，使酶變性失活。本文采用超濾的方法，操作起來比較簡捷，而且因?yàn)槭俏锢矸蛛x，酶活損失非常少。本文研究的果膠酶分子質(zhì)量約為63.96 ku，與張名愛［9］的研究結(jié)果61.4 ku比較接近，張名愛研究的草酸青霉果膠酶最適作用pH值為5.0，最適反應(yīng)溫度為40℃，pH值穩(wěn)定范圍為4.0～6.0，與本文研究的果膠酶最適溫度有一定差距，最適pH值比較接近，穩(wěn)定范圍相對小一點(diǎn)，藍(lán)麗精等［10］研究的果膠酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值5.0，與本研究結(jié)果相近但有少部分區(qū)別，可能是果膠酶產(chǎn)生菌不同，表達(dá)果膠酶的基因不同，造成果膠酶蛋白分子結(jié)構(gòu)有所不同，使得性質(zhì)也有區(qū)別。

中國海域遼闊，海洋微生物資源非常豐富，且容易獲得，海洋中有陸地上不存在的微生物，以海洋微生物出發(fā)，尋求穩(wěn)定性好，活力高的果膠酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，有利于提高我國果膠酶制劑的品質(zhì)。本文為探究海洋真菌所產(chǎn)果膠酶的性質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)等提供了理論指導(dǎo)。

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Purification and enzymatic charactersof pectinase from marine Penicillium expansum

WU Shuang1，ZHANGM in2，PAN Ren-rui2，CAIJing-m in1,2

(1.College of Life Sciences,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036; 2.Schoolof Biologicaland EnvironmentalEngineering,HefeiUniversity,Hefei230601,China)

Pectinase from marine Penicillium expansum was separated and purified by ultrafiltration,DEAESephadex A-50 ion exchange chromatography,Sephadex G-100 gel filtration chromatography.SDS-PAGE of the purified pectinase revealed a single band atan apparentmolecularmassof 63.96 ku.Resultshowed thatpectinasewas purified by 24.13 foldsw ith a yield of 36.32%.The enzymology properties revealed that theoptimal reaction temperaturewas50℃,and theoptimalpH was5.4.Pectinasewasstable in the range of pH4.6-6.2.Mg2+and Ca2+had obviousactivation on pectinase activity,however Cu2+had obvious inhibition.Vmax and Km for jelly powderwere 393.56μg/(m in·m L)and 3.34mg/m L,respectively.

marine Penicillium expansum;pectinase;purification;enzymology properties

Q814.1;TQ925.3

A

2095－1736（2015）03－0037－05

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.037

2014-10-30；

2014-12-01

安徽省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（KJ2012B153）

吳 爽，碩士，從事微生物酶學(xué)和海洋微生物活性天然產(chǎn)物研究，E-mail：wushuangsunshine@163.com。

蔡敬民，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物酶學(xué)和海洋微生物活性天然產(chǎn)物研究，E-mail：caijingmin@hfuu.edu.cn。