磁性微球固定化膠原酶篩選抑制劑的研究

陳 蕊，嚴 月，趙東旭

（北京理工大學生命學院，北京100081）

磁性微球固定化膠原酶篩選抑制劑的研究

陳 蕊，嚴 月，趙東旭

（北京理工大學生命學院，北京100081）

以表面修飾的磁性微球作為載體，以共價結合的方式將膠原酶固定化，從56種中草藥中快速篩選具有抑制作用的種類。結果表明：表面羧基磁性微球與膠原酶能較好地固定化，酶的反應濃度為2mg/m L，并且不影響其活性。以SDS-PAGE電泳的方法作為檢測手段，從56種中草藥中篩選出草河車對膠原酶具有較好的抑制作用。

磁性微球；固定化；膠原酶；中草藥；抑制劑

高分子磁性微球作為一種優(yōu)良的酶固定化載體，能夠顯著提高酶的操作穩(wěn)定性和使用壽命，降低生產成本，便于自動化操作，具有很好的工業(yè)應用前景。膠原酶是基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）中的一種，是一種具有高度專一性的蛋白酶，在人體組織正常代謝及減輕病理損壞中起著重要作用。相關資料表明，基質金屬蛋白酶及其相關組織物調控著細胞外基質的更新［1］，維持細胞的穩(wěn)定性，如腫瘤侵入及擴散轉移、骨關節(jié)炎、心血管疾病等［2］，都與MMPs調控失衡有著密切的關系。目前，MMPs的抑制劑主要可以分為5類［3］，包括異羥肟酸類、反式異羥肟酸類、非異羥肟酸類、非鋅離子結合基類以及各種天然產物。而膠原酶的抑制劑主要有3類，包括天然抑制劑、人工合成抑制劑以及抗體類抑制劑。因此，探索和研究膠原酶天然抑制劑是尋找治療相關疾病所迫切需求的。

基于上述背景，本實驗以表面修飾的磁性微球作為載體，將膠原酶固定化后，從多種中草藥中快速篩選具有抑制作用的種類。在此研究中需要解決的關鍵問題是磁性微球與膠原酶的固定化以及固定化后膠原酶活性的測定，然后利用固定化的膠原酶從中草藥提取液中篩選其抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

表面羧基修飾的磁性微球，購于天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心；Ⅰ型膠原酶，購于北京欣經科生物技術有限公司；Ⅰ型酸溶性膠原蛋白（非純），購于成都新際生物活性膠原開發(fā)有限公司；BCA法微量蛋白質濃度測定試劑盒，購于生工生物工程（上海）有限公司；各種中藥材，均購于北京同仁堂藥店。

1.2羧基磁球對酶的固定化

1.2.1 磁球固定化原理［4］

EDC（1-(3-Dimethylam inopropyl)-3-ethylcarbodiim ide hydrochloride）是可溶于水的碳二亞胺，在酰胺合成中用作羧基的活化試劑，使用時的pH值范圍為4.0～6.0，常和N-羥基琥珀酰亞胺連用，以提高偶聯(lián)效率。

1.2.2羧基磁球與酶的共價連接

［5］，具體操作如下：1）將磁球搖勻后取1000μL于2m L離心管中，在磁分離條件下用MES緩沖液（50mM，pH值6.0）洗3遍，棄上清。2）稱取EDC 20mg溶于200μLMES緩沖液中，N-羥基琥珀酰亞胺20mg溶于200μLMES緩沖液中，即濃度均為100mg/ m L，2種溶液依次加入磁球中混勻。3）將反應樣品放入30℃搖床中，180 r/min，反應30min。4）反應后，在磁分離條件下用PBS緩沖液（10mmol/L，pH值7.4）洗3次，棄上清。加入2mg/m L的酶1m L，在同樣條件下反應1 h。5）用PBS緩沖液清洗4次，每次600μL，收集洗液待測濃度。固定化酶于4℃冰箱中保存待用。

1.3載酶量的測定

通過測定固定化酶洗液中膠原酶水解Ⅰ型膠原蛋白的能力，可知膠原酶的酶活，進而可得出未連接的酶量。根據(jù)BCA法微量蛋白質濃度測定的相關操作摸索出最佳的實驗條件，并作標準曲線［6］。

1.3.1制作標準曲線

1）標準曲線酶濃度的設定與配制（表1）；2）取7支2m L離心管，各管分別加入500μL相應濃度的配制好的酶溶液，然后各管分別加入500μL蛋白工作液，迅速混勻；3）在60℃金屬浴中保溫1 h，冷卻至室溫后，以酶濃度為0的管作對照，在分光光度計上測各管的D562nm值。4）以各管的D562nm為縱坐標，酶濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 磁球載酶量的測定

樣品蛋白質濃度乘以總體積得到洗下的酶的量，總酶量已知，于是：

磁球載酶量=（總酶量-洗液中酶量）（mg）/磁球的量（g）

1）取3支2m L的離心管，其中一管加入500μL蒸餾水作為對照，另外兩管分別加入濃度相同的500μL樣品稀釋液。2）各管分別加入500μL蛋白工作液，迅速混勻，在60℃金屬浴中保溫1 h。冷卻至室溫后，在分光光度計上測各管D562nm值。3）取兩個相同樣品稀釋液的D562nm值的平均值，在標準曲線上確定出該樣品經稀釋后的蛋白質濃度。4）根據(jù)下式計算樣品的蛋白質濃度：

表1 標準曲線測定用酶濃度Table 1 The determ ination of the standard curveof enzyme concentration

樣品蛋白濃度（μg/m L）=該樣品稀釋后的蛋白質濃度×樣品稀釋倍數(shù)。

1.4 固定化酶的活性檢測

據(jù)相關文獻可知膠原酶活力的測定方法，如羥脯氨酸法［7］、膠原懸浮分析法［8］、放射性標記法［9］、熒光法［10］、考馬斯亮藍法［11］等。然而以上多種方法中，或需要特殊儀器設備，或操作過程繁瑣。本實驗最終確定利用SDS-PAGE電泳的方法對膠原酶活性進行測定，該方法操作簡便，可信度高。SDS-PAGE方法參考文獻［12］。

1）SDS-PAGE凝膠配制：濃縮膠濃度為5%、分離膠濃度為10%。2）凝膠板的制備：將混勻的分離膠約3.7m L加到玻璃板的縫隙內，用1m L蒸餾水水封。約30min后，將上層水倒去，加入約1m L濃縮膠，插入樣品梳。約30m in后，小心拔出梳子。向電泳槽中加入電極緩沖液。3）上樣、電泳。制備好相應的電泳樣品，用微量注射器取10μL加到上樣槽中，針頭盡量插入上樣槽內部。進樣結束后打開電源，將電壓調至70 V開始電泳，約15min后，樣品在電場作用下進入分離膠。再將電壓調至150V左右。待染料前沿遷移至距硅膠框底邊1 cm左右，停止電泳。

1.5 中草藥的提取

查閱相關文獻［13-16］，本研究采用56種可能具有相關疾病防治的中草藥，根據(jù)其藥用部位，分為塊根塊莖類、全草類、果實類、葉類、礦物類6大類中藥。中草藥的處理步驟如下：

1）取所需中藥材分別進行粉粹，與蒸餾水以1∶10比例混合，靜置2 h，于95℃進行煎煮1～2 h。2）煎煮后靜置冷卻至室溫，然后用布氏漏斗過濾、10000 r/min離心30min，收集中草藥上清液。3）取上述中草藥上清液于分液漏斗中，與水飽和的正丁醇以1∶1的比例混合，振蕩后靜置12 h。待兩相分層后，取下層的水相。4）經正丁醇萃取后的水相，用70%的乙醇進行沉淀，萃取后于10000 r/m in的轉速下離心20min，取上清液備用。

2 結果與分析

2.1所用膠原酶以及膠原蛋白電泳檢測

圖1 膠原酶與膠原蛋白電泳圖Fig 1 Theelectrophorogram of collagenaseand collagen proteina—Ⅰ型膠原酶；b—Ⅰ型膠原蛋白

圖1表明，Ⅰ型膠原酶分子質量為120 ku；膠原蛋白的最大條帶在100～150 ku之間，除此之外還有其他條帶，是因為蛋白樣品不純所致。

2.2羧基磁球固定化酶

圖2中未加交聯(lián)劑EDC的羧基磁球固定化酶是按照羧基磁球固定化酶的操作步驟，以排除磁球對膠原酶本身的吸附作用和驗證清洗的步驟是否徹底。從電泳圖中可以看出，膠原蛋白的條帶和未加交聯(lián)劑的羧基磁球固定化酶與蛋白溶液反應后的條帶幾乎相同，說明不加交聯(lián)劑膠原酶不會連接到羧基磁球上，而羧基磁球固定化酶與蛋白溶液反應后蛋白條帶明顯變淺，說明膠原酶已經被成功地固定到羧基修飾的磁球上并發(fā)揮良好的活性水解作用。

2.3羧基磁球固定化酶反應時酶濃度對反應效果的影響

圖2 羧基磁球固定化酶檢測效果Fig 2 The effectof immobilized collagenasew ith carboxyl-modified magneticm icrospheres1—marker；2—膠原蛋白；3—未加交聯(lián)劑EDC的羧基磁球固定化酶與膠原蛋白反應作陰性對照；4—羧基磁球固定化酶與膠原蛋白反應。

圖3 反應酶濃度對固定化酶效果的影響Fig 3 Effectsof differentenzyme concentration on theeffectof immobilized enzyme1—marker；2—膠原蛋白；3—酶濃度0.5mg/m L；4—酶濃度1mg/m L；5—酶濃度1.5mg/m L；6—酶濃度2mg/m L；7—酶濃度2.5mg/m L。

圖3表明，隨著酶濃度的增高，固定化酶的水解反應也越來越徹底，說明酶的濃度增加有利于酶的固定化反應，直到酶濃度為2mg/m L時，固定化酶的水解效果最好，但是酶的濃度繼續(xù)增高時，固定化酶的水解程度不再增加，反而有少許下降，這可能是由于酶的濃度過高造成空間上的阻礙，不利于酶的固定化。于是實驗中采用酶的反應濃度為2mg/m L。

2.4 載酶量的測定

測定羧基修飾的磁球固定化反應后洗液中酶的比活，取均值。測量3次固定化反應后取平均值，參照繪制的酶標準曲線計算洗液中酶的濃度，可知洗下來的酶的量。具體數(shù)值見表2。

表2 羧基磁球固定化酶洗下的酶濃度Table 2 The determ ination of the concentration of immobilized collagenasew ith carboxyl-modifiedmagneticm icrospheres

由表2得出的洗下的酶的量0.574mg，酶的總量2 mg，磁球量5 g，因此磁球的載酶量為：

羧基磁球的載酶量=（2-0.574）/5×1000=285.2mg/g

據(jù)劉天金介紹，在綜合利用互聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)、人工智能等現(xiàn)代信息技術和裝備的前提下，傳統(tǒng)的植保工作將逐漸演變成為一種數(shù)據(jù)集中和共享的方式——在此基礎之上，技術融合、業(yè)務融合、數(shù)據(jù)融合都將逐步實現(xiàn)。

2.5 中草藥的抑制效果

1）所用中草藥的大規(guī)模篩選。

圖4表明，塊莖1組中藥對酶有很強的抑制作用，塊莖2組、塊莖3組、葉類、礦物類、果實類、全草類沒有抑制作用。

2）塊莖1組中具有抑制效果中藥的確定。

圖5表明，3種中草藥中，只有草河車對膠原酶的水解活性有抑制作用。

3 討論

圖4 各大類中藥抑制效果Fig 4 Effectsof themajor categoriesof Chineseherbals1—膠原蛋白；2—膠原酶與膠原蛋白蛋白反應；3—塊莖1組；4—塊莖2組；5—塊莖3組；6—葉類；7—全草類；8—果實類；9—礦物類；10—膠原酶。

圖5 草河車·重樓、貓爪草·毛茛、天葵子·毛茛的抑制效果Fig 5 Effectsof Parispolyphylla Sm ith,Ranunculus ternatus Thunb and SemiaquilegiaadoxoidesMak1—marker；2—草河車（2min）；3—貓爪子（2min）；4—天葵子（2m in）；5—草河車（5m in）；6—貓爪子（5m in）；7—天葵子（5m in）；8—膠原蛋白；9—膠原酶。

高活性的膠原酶與多種疾病相關，其抑制劑在疾病治療方面具有重要的作用，針對膠原酶的活性進行靶向治療是近年來的研究熱點之一。國內對膠原酶抑制劑的研究主要集中在對常見藥物的抑制效果的測定，國外則大力開發(fā)化學合成的抑制劑，從分子化學結構的角度設計新的抑制劑和修飾已有的抑制劑。但國內外都很少從天然產物中嘗試尋找膠原酶的抑制成分。本研究主要從天然中草藥中尋找膠原酶抑制劑，我國在中草藥資源上具有獨特的優(yōu)勢，開發(fā)中草資源可以推動中藥走向國際舞臺。

本研究采用EDC作為交聯(lián)劑成功地將Ⅰ型膠原酶共價結合到羧基磁性微球上，通過對照實驗可知交聯(lián)劑EDC在固定化過程中是必要的。并且該固定化并不影響膠原酶的活性。實驗數(shù)據(jù)顯示，在酶的反應濃度為2mg/m L時，固定化酶的水解效果最好。膠原酶與羧基磁球的共價結合是本研究進行的關鍵，該技術的解決為后面膠原酶抑制劑的篩選奠定了基礎，對于膠原酶的固定化有一定的參考價值。從傳統(tǒng)中草藥中篩選活性成分是遴選藥物分子的重要手段之一。本研究采用了一種比較快速的方法進行篩查，即對篩選的批量中草藥進行分組，確定有活性的中藥組后再分別進行活性篩查。從初步的研究結果看，草河車對膠原酶有一定的抑制作用，對之后的膠原酶抑制劑研究有一定的借鑒作用。我們接下來的工作就是通過色譜分析確定草河車中哪種活性成分對膠原酶有抑制作用，并進行相關的分析。

參考文獻：

［1］Cawston T E,Galloway W A,Merce E,etal.Purification of rabbit bone inhibitor of eollagenase［J］.Biochem ical Journal,1981,195: 159-165.

［3］涂國剛,黃惠明,熊 芳，等.基質金屬蛋白酶抑制劑的研究進展［J］.中國新藥與臨床雜志,2008,3(27):219-226.

［4］Zhu Y H,Wang QB,Gu HC,etal.Preparation of surface functionalmagneticmicrospheres and theirapplication in nucleic acid separation and enzyme immobilization［J］.Acta Academiae Medicinae Sinicae,2002,24:118-124.

［5］Jiang D S,Long SY,Huang J,etal.Immobilization of pycnoporus sanguineus laccase on magnetic chitosan m icrospheres［J］.Biochem icalEngineering Journal,2005,25:15-23.

［6］劉雅超,劉 旭,白鴻源,等.蛋白質定量分析的研究進展［J］.中國民族民間醫(yī)藥,2009,18（8）：49-50.

［7］劉 芳,李德富,林 煒，等.羥脯氨酸含量的測定方法與應用［J］.中國皮革,2007,36(15):51-54.

［8］李國英,張忠楷,付 強，等.膠原的形態(tài)分類及其生理機能［J］.陜西科技大學學報,2004,22(3):80-82.

［9］張自強,趙東旭,楊新林.羥脯氨酸的研究與開發(fā)［J］.氨基酸和生物資源,2006,28(1):55-58.

［10］趙元暉,曾名勇,郭 瑤，等.羅非魚骨骼肌中膠原蛋白分解酶的提取純化及活性［J］.現(xiàn)代食品科技,2006,22(2):40-42.

［11］王 睿,李志強,陳 敏，等.膠原酶及其活性測定方法的研究進展［J］.中國皮革,2007,36(1):27-31.

［12］趙東旭,路秀玲,蘇志國.聚乙二醇對血紅蛋白離子交換層析行為的影響［J］.北京理工大學學報,2004,24（10）：924-928.

［13］劉延澤,陳士林,馬 培,等.中草藥中發(fā)現(xiàn)新抗癌藥物的途徑［J］.現(xiàn)代藥物與臨床,2012,27（4）：323-337.

［14］裴艷霞.談中藥抗腫瘤［J］.光明中醫(yī),2011,21(12):128-129.

［15］杜 琴,胡 兵,沈克平.抗癌中藥配伍研究［J］.中國實驗方劑學雜志,2010,20（13）:43-44.

［16］鄭 康,耿 耘.常見活血止痛類中藥抗腫瘤研究進展［J］. 2014,32（2）:252-253.

Research of screening inhibitorsof collagenase immobilized by magneticm icrospheres

CHENRui,YANYue,ZHAODong-xu
（Beijing Institute of Technology,Schoolof Life Science,Beijing 100081,China）

The presentpaperused surface-modifiedmagneticm icrospheresasa carrierof collagenase immobilized by covalentbonding to screen the kindsw ith inhibition on collagenase from 56 kinds of Chinese herbals.The results showed thatcollagenase could be immobilized better in carboxyl-modifiedmagneticm icrosphereswhen the optimum concentration of enzymewas 2mg/m L.The immobilized enzyme still keptnormal activity after immobilization.The SDS-PAGE was introduced to exam the hydrolysis degree by collagenase in existence of Chinese herbalextract.Thismethod could identify quickly Parispolyphylla Sm ith w ith inhibition to collagenase from 56 kindsof Chinese herbals.

magneticm icrospheres;immobilization;collagenase;herbals;inhibitors

Q814

A

2095－1736（2015）03－0021－04

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.021

2014-10-17；

2014-10-21

國家自然科學基金資助項目（21175011）

陳 蕊，碩士研究生，專業(yè)方向為生物學，E-mail：rui618310@163.com；

趙東旭，博士，研究生導師，研究方向：主要生物活性成分的分離分析，E-mail:zhaodx@bit.edu.cn。