脂肪酸結(jié)合蛋白3對(duì)足細(xì)胞脂肪代謝的影響

高 清 徐 波 郭漢城 劉俊蘭 關(guān)天俊

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脂肪酸結(jié)合蛋白3對(duì)足細(xì)胞脂肪代謝的影響

高 清 徐 波 郭漢城 劉俊蘭 關(guān)天俊

目的：觀察脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)過(guò)度增加對(duì)足細(xì)胞脂肪代謝的影響。 方法：慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠永生化足細(xì)胞系(HSMPs)以構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FABP3的細(xì)胞系。將FABP3-siRNA轉(zhuǎn)染至HSMPs中沉默F(xiàn)ABP3，篩選干擾效率最大的FABP3-siRNA片段進(jìn)行后續(xù)干擾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：(1)正常足細(xì)胞組;(2)NC-siRNA足細(xì)胞組;(3)FABP3-siRNA足細(xì)胞組;(4)NC足細(xì)胞組;(5)FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞組;(6)正常足細(xì)胞+棕櫚酸(PA)組;(7)NC-siRNA足細(xì)胞+PA組;(8)FABP3-siRNA足細(xì)胞+PA組;(9)NC足細(xì)胞+PA組;(10)FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞+PA組。比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi) TG和游離脂肪酸的含量。定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中過(guò)氧化物酶增殖激活受體α(PPARα)、酰基輔酶A氧化酶3(ACOX3)mRNA的表達(dá)。Western Blot法檢測(cè)PPARα、ACOX3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：與正常足細(xì)胞組相比，F(xiàn)ABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞組細(xì)胞內(nèi)三酰甘油(TG)和游離脂肪酸水平增加(P<0.05)，而FABP3-siRNA足細(xì)胞組TG和游離脂肪酸水平下降(P<0.05)。不論在正常環(huán)境還是PA環(huán)境下，與正常足細(xì)胞組相比，F(xiàn)ABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞組PPARα mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，而ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)； FABP3-siRNA足細(xì)胞組PPARα mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，而ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。與FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞組相比，F(xiàn)ABP3-siRNA足細(xì)胞組PPARα mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；加入PA后，F(xiàn)ABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞+PA組和FABP3-siRNA 足細(xì)胞+PA組之間PPARα mRNA和蛋白表達(dá)、ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。 結(jié)論：FABP3過(guò)度增加可導(dǎo)致足細(xì)胞脂肪代謝紊亂，抑制FABP3過(guò)度增加可糾正足細(xì)胞脂肪代謝紊亂狀態(tài)。該研究結(jié)果提示抑制FABP3表達(dá)可能對(duì)代謝因素如糖尿病、肥胖、高脂血癥所致的足細(xì)胞損傷有一定防御和治療作用。

脂肪酸結(jié)合蛋白3 過(guò)氧化物酶增殖激活受體α 酰基輔酶A氧化酶3 足細(xì)胞

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，除參與維持毛細(xì)血管袢正常結(jié)構(gòu)、腎小球基膜的更新和修復(fù)外，在腎小球固有細(xì)胞功能調(diào)節(jié)及機(jī)體免疫應(yīng)答中，足細(xì)胞也起著重要作用。既往大量研究認(rèn)為，足細(xì)胞損傷是腎小球損傷的中心環(huán)節(jié)，多種損傷因素(如代謝、免疫、炎癥、毒物、感染、環(huán)境、遺傳背景等)都能直接或間接影響足細(xì)胞，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、蛋白尿形成、腎小球硬化或間質(zhì)纖維化等。脂毒性-足突細(xì)胞中心觀點(diǎn)認(rèn)為 podocin 和 nephrin附著于足突細(xì)胞間裂孔隔膜的類固醇(脂質(zhì)閥)上，促進(jìn)了podocin-nephrin 和 podocin 轉(zhuǎn)運(yùn)受體與陽(yáng)離子通道6(TRPC-6)的交互作用，進(jìn)而維持了足突細(xì)胞的功能。如果脂肪酸氧化出現(xiàn)異常，可能影響podocin蛋白的棕櫚化作用、膜的嵌入及脂質(zhì)閥的脂質(zhì)構(gòu)成，從而促進(jìn)腎小球高濾過(guò)而產(chǎn)生白蛋白尿。仇麗茹等[1]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂肪酸可導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)脂滴增加，Caspase3/7明顯增高，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。因此提出脂肪是維持腎臟細(xì)胞功能的必要物質(zhì)，但也可導(dǎo)致腎臟炎性反應(yīng)、纖維化作用甚至壞死[2-3]。

脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)是FABP超家族成員之一，其又稱為心型FABP，既往認(rèn)為它主要分布于心肌和骨骼肌。近期Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞中也存在FABP3，并且在肥胖相關(guān)性腎病患者腎組織足細(xì)胞中表達(dá)異常增高，與蛋白尿水平呈正相關(guān)。但FABP3對(duì)足細(xì)胞脂肪代謝的影響極其機(jī)制尚不清楚。

RNA干擾技術(shù)是一種新興的基因治療技術(shù)，是發(fā)生于mRNA水平的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)?？稍诓溉閯?dòng)物細(xì)胞組織內(nèi)起基因封閉作用，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無(wú)須像反義寡核苷酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾才能提高其半衰期，而且干擾RNA(siRNA)能在低于反義寡核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，使靶基因降至低水平甚至完全“敲除”，從而產(chǎn)生缺失突變型[5-6]。因此，我們采用小鼠永生化足細(xì)胞系(HSMPs細(xì)胞)，利用LV5(含EGF和puro)質(zhì)粒為骨架，將FABP3構(gòu)建進(jìn)質(zhì)粒，感染HSMPs細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)FABP3的HSMPs細(xì)胞系。將siRNA轉(zhuǎn)染至HSMPs細(xì)胞系中干擾FABP3，篩選最佳FABP3-siRNA序列并利用最佳的siRNA沉默F(xiàn)ABP3。重點(diǎn)觀察穩(wěn)定表達(dá)FABP3的HSMPs細(xì)胞系和沉默F(xiàn)ABP3的HSMPs細(xì)胞系脂質(zhì)代謝與正常HSMPs細(xì)胞系之間的不同。探討FABP3在足細(xì)胞中的作用，為治療各種可能導(dǎo)致足細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂的慢性腎臟病提供新的可能性思路。

材料和方法

藥品和試劑 棕櫚酸(sigma公司)，F(xiàn)ugene Xtreme transfection reagent(Roche公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本takara公司)，F(xiàn)ABP3、PPARα抗體(美國(guó)abcam公司)，ACOX3抗體(美國(guó)pierce公司)、FABP3 siRNA(上海吉瑪生物公司)、三酰甘油(TG)測(cè)定試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司)、游離脂肪酸和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

穩(wěn)定表達(dá)FABP3的HSMPs細(xì)胞系 過(guò)表達(dá)FABP3慢病毒訂購(gòu)自上海吉瑪生物公司，綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記。種1×105個(gè)HSMPs細(xì)胞(由美國(guó)Shankland教授授權(quán)，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科劉志紅院士饋贈(zèng))于六孔板中，加入MOI=1×107滴度的病毒培養(yǎng)，觀察綠色熒光表達(dá)情況。加入 1 μg/ml的嘌呤霉素篩選細(xì)胞，2周后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)及Western Blot法檢測(cè)FABP3表達(dá)情況。

FABP3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將8%FABP3-siRNA轉(zhuǎn)染液加入種有1×105個(gè)HSMPs細(xì)胞的六孔板中，24h后取出細(xì)胞，用RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)FABP3表達(dá)情況。

細(xì)胞分組處理 根據(jù)每組需求，六孔板每個(gè)孔種2×105個(gè)所需細(xì)胞，轉(zhuǎn)染siRNA和(或)者加入30 μmol/L棕櫚酸(PA)即不飽和脂肪酸，由此將細(xì)胞分組為：(1)正常足細(xì)胞組;(2)NC-siRNA足細(xì)胞組;(3)FABP3-siRNA足細(xì)胞組;(4)NC足細(xì)胞組;(5)FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞組;(6)正常足細(xì)胞+PA組;(7)NC-siRNA足細(xì)胞+PA組;(8)FABP3-siRNA足細(xì)胞+PA組;(9)NC足細(xì)胞+PA組;(10)FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞+PA組。其中NC為轉(zhuǎn)染一個(gè)錯(cuò)配序列的陰性對(duì)照(negative control)。處理48h后，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白。

比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸含量 收獲細(xì)胞后，用PBS重復(fù)洗 3 次，加入PBS 500 μl后放入-70℃冰箱反復(fù)凍融3次，然后按照試劑盒說(shuō)明書上提供的比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸的含量。

RT-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞RNA，檢測(cè)濃度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(表1)。采用RT-PCR儀以20μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR熱循環(huán)參數(shù)：37℃ 15 min→85℃ 5 s→95.0 ℃10 min→(95.0 ℃5 s→60.0 ℃1 min)×40。樣本擴(kuò)增結(jié)果用GADPH濃度校正。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物分析

PPARα：過(guò)氧化物酶增殖激活受體α；ACOX3：酰基輔酶A氧化酶3；FABP3：脂肪酸結(jié)合蛋白3Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞后加入蛋白裂解液獲取總蛋白，用BCA法測(cè)蛋白濃度。每孔30 μg蛋白上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶，室溫下封閉1h，洗滌后加入兔抗小鼠PPARα多克隆抗體(1∶ 1 000)、兔抗小鼠ACOX3多克隆抗體(1∶ 1 000)4℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG(1∶ 5 000)室溫孵育1h，洗滌后加入millipore ECL顯色液曝光。Chremi DOC XRS凝膠成像儀照相，以Quantity One圖像分析軟件測(cè)定條帶的吸光度值，以目的蛋白條帶與β-actin條帶吸光度的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

最佳FABP3-siRNA序列的篩選 我們?cè)O(shè)計(jì)了兩組FABP3的siRNA片段，片段信息如下：Fabp3-Mus-298 GCAGGAGACAACACUAACUTT；Fabp3-Mus-369 GTGAGCACTCGGACTTAT。轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞后24h RT-PCR檢測(cè)FABP3的表達(dá)變化，篩選出干擾效果更強(qiáng)的為Fabp3-Mus-298片段用于下游實(shí)驗(yàn)。

FABP3 siRNA以及過(guò)表達(dá)mRNA水平和蛋白水平檢測(cè) mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FABP3慢病毒感染足細(xì)胞后，足細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FABP3，與對(duì)照組比較，F(xiàn)ABP3在足細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；經(jīng)FABP3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染感染的足細(xì)胞，與對(duì)照組比較，足細(xì)胞FABP3表達(dá)明顯受到抑制，F(xiàn)ABP3的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)(圖1)。

圖1 FABP3 siRNA及過(guò)表達(dá)FABP3 mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)A:FABP3 siRNA以及過(guò)表達(dá)mRNA水平檢測(cè);B:FABP3 siRNA以及過(guò)表達(dá)蛋白水平檢測(cè);ctrl:正常足細(xì)胞組；NC：陰性對(duì)照，將足細(xì)胞轉(zhuǎn)染一個(gè)錯(cuò)配序列；FABP3:脂肪酸結(jié)合蛋白3；**：與ctrl組比較,P<0.01

不同F(xiàn)ABP3表達(dá)水平對(duì)足細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸的影響 比色法結(jié)果顯示，在PA作用下足細(xì)胞TG和游離脂肪酸水平增加(P<0.05)。過(guò)表達(dá)FABP3慢病毒感染足細(xì)胞后，足細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸水平增加(P<0.05)；經(jīng)FABP3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染感染的足細(xì)胞，與正常對(duì)照組比較，TG和游離脂肪酸水平降低(P<0.05)。FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞在PA作用下TG和游離脂肪酸水平增加更加明顯(P<0.01)；FABP3-siRNA足細(xì)胞在PA作用下，TG和游離脂肪酸水平增加不明顯(P>0.05)(表2)。

表2 FABP3 siRNA以及FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞在PA干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸水平變化

實(shí)驗(yàn)組TG(mg/gprotein)游離脂肪酸(μmol/gprotein)正常足細(xì)胞組156±18332±24NC?siRNA足細(xì)胞組148±20350±39FABP3?siRNA足細(xì)胞組81±12?196±16?NC足細(xì)胞組164±35328±23FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞組225±37?458±45?正常足細(xì)胞+PA組239±46?567±58?NC?siRNA足細(xì)胞+PA組245±39?579±72?FABP3?siRNA足細(xì)胞+PA組136±27303±42NC足細(xì)胞+PA組230±40?572±53?FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞+PA組332±23??798±54??

FABP3:脂肪酸結(jié)合蛋白3;NC:陰性對(duì)照;TG:三酰甘油；PA：棕櫚酸；*：與正常對(duì)照組比較,P<0.05；**：與正常對(duì)照組比較,P<0.01

不飽和脂肪酸干預(yù)狀態(tài)下足細(xì)胞不同F(xiàn)ABP3表達(dá)水平對(duì)PPARα和ACOX3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 定量PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FABP3慢病毒感染足細(xì)胞后，足細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均上升(P<0.05)。經(jīng)FABP3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染感染的足細(xì)胞，與正常對(duì)照組比較，PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平均上升(P<0.05)，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)。正常足細(xì)胞經(jīng)PA干預(yù)后，PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均上升(P<0.05)。過(guò)表達(dá)FABP3慢病毒感染足細(xì)胞在PA干預(yù)下，PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平下降更加明顯(P<0.05)，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平上升更加明顯(P<0.05)。在PA干預(yù)下，經(jīng)FABP3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染感染的足細(xì)胞較正常足細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平高(P<0.05)，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平低(P<0.05)(圖2、3)。

圖2 FABP3 siRNA以及FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞在PA干預(yù)下PPARα、ACOX3 mRNA水平變化A:PPARα mRNA表達(dá)水平;B:ACOX3 mRNA水平;PPARα：過(guò)氧化物酶增殖激活受體α；ACOX3：?；o酶A氧化酶3；FABP3：脂肪酸結(jié)合蛋白3；PA：棕櫚酸；ctrl：正常足細(xì)胞組；NC：陰性對(duì)照；a：與ctrl組比較,P<0.05；b：與ctrl+PA對(duì)照組比較,P<0.05；c：與FABP3+PA組比較,P<0.01

圖3 FABP3 siRNA及FABP3過(guò)表達(dá)足細(xì)胞在PA干預(yù)下PPARα、ACOX3 蛋白水平變化A:PPARα、ACOX3 蛋白表達(dá)水平;B:PPARα蛋白表達(dá)水平半定量測(cè)定;C:ACOX3蛋白表達(dá)水平半定量測(cè)定;PPARα：過(guò)氧化物酶增殖激活受體α；ACOX3：酰基輔酶A氧化酶3；FABP3：脂肪酸結(jié)合蛋白3；PA：棕櫚酸；ctrl：正常足細(xì)胞組；NC：陰性對(duì)照；a：與ctrl組比較,P<0.05；b：與ctrl+PA對(duì)照組比較,P<0.05；c：與FABP3+PA組比較,P<0.01

討 論

足細(xì)胞在腎臟中具有重要作用，除參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障、維持毛細(xì)血管袢正常結(jié)構(gòu)、輔助腎小球基膜的更新和修復(fù)外，在腎小球固有細(xì)胞功能調(diào)節(jié)以及機(jī)體免疫應(yīng)答中，足細(xì)胞也起著重要作用。既往研究認(rèn)為足細(xì)胞損傷是腎小球損傷的中心環(huán)節(jié)，可導(dǎo)致蛋白尿形成、腎小球硬化或間質(zhì)纖維化等。脂毒性-足細(xì)胞中心觀點(diǎn)認(rèn)為脂肪酸氧化異?？赡苡绊憄odocin蛋白的棕櫚化作用、膜的嵌入及脂質(zhì)閥的脂質(zhì)構(gòu)成，可導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腎小球高濾過(guò)而產(chǎn)生白蛋白尿[1-3]。此外，足細(xì)胞還可能分泌脂肪細(xì)胞因子如內(nèi)脂素參與機(jī)體代謝紊亂[7-8]。因此提出脂肪過(guò)度增加可影響足細(xì)胞功能。

FABP是一組分子量約為14～15 kD的低分子胞質(zhì)蛋白，分為FABP1、FABP2、FABP3、FABP4等亞型，參與細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸運(yùn)輸，在細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外脂肪酸的濃度，并將脂肪酸從細(xì)胞膜運(yùn)送到脂肪酸氧化、TG和磷脂的合成部位，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種生化反應(yīng)過(guò)程。FABP廣泛分布于多種組織細(xì)胞中，不同型的FABP以及同型FABP在不同細(xì)胞及組織內(nèi)有其特殊性[9]。腎臟主要分布著三種FABP。Kamijo-Ikemori等[10]報(bào)道FABP3集中分布于腎小球和遠(yuǎn)端腎小管上皮。Guan等[11]發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞上分布有FABP4。Oyama[12]的研究證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞中存在FABP1。近期Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞中也存在FABP3，并且在肥胖相關(guān)性腎病患者腎組織足細(xì)胞中表達(dá)異常增高，與蛋白尿水平呈正相關(guān)。但FABP3對(duì)足細(xì)胞脂肪代謝的影響極其機(jī)制尚不清楚。因此，本文試圖通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)觀察足細(xì)胞FABP3過(guò)度表達(dá)和抑制狀態(tài)下足細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝的情況及反映脂肪代謝的兩個(gè)指標(biāo)PPARα、ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FABP3過(guò)度增加可導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝紊亂，PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；抑制FABP3表達(dá)可降低足細(xì)胞內(nèi)TG及游離脂肪酸濃度，上調(diào)足細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

PPARα可調(diào)節(jié)與脂肪酸氧化相關(guān)的酶的基因，可通過(guò)其他核轉(zhuǎn)錄因子而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因。PPARα的功能改變與肥胖的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系。PPARα可能作為一種重要的脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝失衡的過(guò)程。足細(xì)胞中部分蛋白基因編碼區(qū)有特異的啟動(dòng)因子，PPARα可直接調(diào)節(jié)足細(xì)胞。激活PPARα后對(duì)糖尿病受累足細(xì)胞有保護(hù)作用，可抑制核因子(NF-κB)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad3 信號(hào)通路[13]。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)的小鼠腎病綜合征模型中PPARα表達(dá)下降，PPARα激動(dòng)劑可通過(guò)穩(wěn)定nephrin表達(dá)并抑制足細(xì)胞凋亡改善這一疾病模型[14]。在體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)PPARα可通過(guò)降低caspase-3表達(dá)、增加Bcl-2表達(dá)而改善阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[15]。在多種損傷模型中發(fā)現(xiàn)PPARα可通過(guò)保護(hù)Bcl-2、Bax和nephrin表達(dá)而防治足細(xì)胞損傷[16]。本研究結(jié)果提示FABP3過(guò)度增加可能通過(guò)降低PPARα表達(dá)而導(dǎo)致足細(xì)胞更易受外界因素?fù)p傷，包括代謝、免疫、炎癥、毒物、感染、環(huán)境等；抑制FABP3可能通過(guò)增加PPARα表達(dá)而起到保護(hù)足細(xì)胞的作用。本研究選取PA作為外界干擾因素，發(fā)現(xiàn)抑制FABP3過(guò)度增加仍可防止PA作用下足細(xì)胞PPARα表達(dá)降低，從而可能起到保護(hù)足細(xì)胞的作用。

ACOX3是過(guò)氧化物酶體脂肪酸β氧化過(guò)程中的重要氧化酶之一，過(guò)氧化物酶體是脂肪酸氧化的重要場(chǎng)所。在哺乳動(dòng)物中，過(guò)氧化物酶體主要氧化分解長(zhǎng)鏈、超長(zhǎng)鏈和支鏈脂肪酸，過(guò)氧化物酶體的功能障礙會(huì)造成很多脂肪酸的過(guò)度沉積，引起代謝疾病。組織表達(dá)規(guī)律研究表明，ACOX3在小鼠白色脂肪組織中的表達(dá)量最高。高脂系個(gè)體ACOX3基因的表達(dá)量是低脂系的兩倍多，ACOX3對(duì)脂肪的沉積有重要影響[17-18]。本研究結(jié)果提示FABP3過(guò)度增加可能通過(guò)ACOX3表達(dá)增加而導(dǎo)致脂肪在組織中過(guò)度沉積，在代謝因素所致足細(xì)胞損傷中可能起重要作用；抑制FABP3過(guò)度增加可能通過(guò)降低ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)而保護(hù)足細(xì)胞。

從研究結(jié)果看，我們認(rèn)為FABP3過(guò)度增加可導(dǎo)致足細(xì)胞脂肪代謝紊亂，細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸水平增加，抑制FABP3表達(dá)可糾正足細(xì)胞脂肪代謝紊亂狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)TG和游離脂肪酸水平下降。FABP3過(guò)度增加可導(dǎo)致足細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；抑制FABP3可上調(diào)足細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。尤其在外界因素PA干預(yù)下兩者差異更加顯著。由此提示抑制FABP3表達(dá)可能通過(guò)改善足細(xì)胞脂肪代謝，調(diào)控PPARα、ACOX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平起到保護(hù)足細(xì)胞、防止足細(xì)胞受外界因素?fù)p傷的作用。

小結(jié):本研究為治療足細(xì)胞損傷相關(guān)腎臟病提供了一種新的可行性方案，不足之處是目前對(duì)FABP3如何影響PPARα和ACOX3表達(dá)的機(jī)制尚未明確，我們將在今后的研究中進(jìn)一步探索相關(guān)機(jī)制，并進(jìn)一步觀察FABP3在足細(xì)胞中的其他作用。

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(本文編輯 春 江)

Effects of fatty acid binding protein 3 on the fat metabolism of podocyte

GAOQing,XUBo,GUOHancheng,LIUJunlan,GUANTianjun

DepartmentofNephrology,ZhongshanHospital,XiamenUniversity,Xiamen361004,ChinaCorrespondingauthor:GUANTianjun(E-mail:guantianjun@aliyun.com)

Objective：To investigate the effect and mechanisms of fatty acid binding protein 3 (FABP3) on the fat metabolism of podocyte. Methodology：We transfect the lentivirus vector to heat-sensitive mouse podocytes(HSMPs) to construct the cell line which express FABP3 stabile and excessively. Two siRNAs were designed and synthesized. One of them that was capable of silencing FABP3 more effectively in HSMPs was chosen to do the next interference study. They were divided into ten cell groups: (1) normal control group; (2) NC-siRNA group; (3) FABP3-siRNA group; (4) NC group; (5) excessive express FABP3 group; (6)normal control+palmic acid (PA) group; (7) NC-siRNA+PA group; (8) FABP3-siRNA+PA group; (9) NC+PA group; (10) excessive express FABP3+PA group. Triglycerides (TG) and free fatty acid contents in podocytes were determined by colorimetric method. The mRNA expression of peroxisome proliferator activated receptors α (PPARα) and ACOX3 of each group was determined by using Real-Time PCR. The proteins of PPARα and ACOX3 were examined by using Western blot. Results：Compared with normal control group,the levels of TG and free fatty acid were up-regulated in group5 (FABP3 group),while down-regulated in group3 (FABP3-siRNA group) (P<0.05). Compared with normal control group,mRNA and protein expressions of PPARα were down-regulated in FABP3 group (P<0.05),while mRNA and protein expressions of ACOX3 were up-regulated in FABP3 group (P<0.05) with or without PA. Compared with normal control group,mRNA and protein expressions of PPARα were up-regulated in FABP3-siRNA group (P<0.05),while mRNA and protein expressions of ACOX3 were down-regulated in FABP3-siRNA group with or without PA (P<0.05). Compared with FABP3 group,mRNA and protein expressions of PPARα were up-regulated in FABP3-siRNA group (P<0.05),while mRNA and protein expressions of ACOX3 were down-regulated in FABP3-siRNA group (P<0.05). There was more conspicuous statistical difference between FABP3+PA group and FABP3-siRNA+PA group in the expression of mRNA and proteins of PPARα and ACOX3 (P<0.01). Conclusion：The excessive expression of FABP3 may induce fatty metabolic disturbance in podocytes. Inhibiting the expression of FABP3 may improve the fatty metabolic disturbance in podocytes. These results prompted that inhibiting the expression of FABP3 may ameliorate the metabolic disorder induced podocyte injury,such as diabetes mellitus, obesity and dyslipidemia.

Fatty acid binding protein 3 peroxisome proliferator activated receptors α Acyl-Coenzyme A oxidase 3 podocyte

福建省自然科學(xué)基金青年創(chuàng)新項(xiàng)目(2012D054)

福建省廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科(廈門，361004)

關(guān)天俊(E-mail:guantianjun@aliyun.com)

2015-05-12

? 2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有