10例Gitelman綜合征患者SLC12A3基因的檢測

王 艷 韓正斌 邵樂平 欒 健 劉 軍

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10例Gitelman綜合征患者SLC12A3基因的檢測

王 艷1韓正斌1邵樂平1欒 健2劉 軍3

目的：對青島地區(qū)10例可疑Gitelman綜合征患者致病基因SLC12A3和CLCNKB的突變特點進行分析。 方法：通過直接測序的方法進行突變分析。選取100例健康人作為對照。 結果：共確定SLC12A3基因9個突變位點，其中3個為新突變位點，包括2個錯義突變：Glu429Lys,Ala264Gly；1個缺失突變：1740delC。6個已報道過的突變，其中包括5個錯義突變：Cys430Gly，Asp486Asn，Ser283Tyr，Thr163Met,Arg913Gln；1個缺失突變：2877_2878delAC。10例患者中8例攜帶Ala264Gly純合突變,4例攜帶Asp486Asn雜合突變，大部分患者為復合雜合突變。 結論：本研究共發(fā)現9個突變位點，其中3個新突變位點。

Gitelman綜合征 突變 SLC12A3基因

Gitelman綜合征(GS)是一種常染色體隱性遺傳性疾病(OMIN 263800)，為腎單位遠曲小管重吸收Na-Cl障礙造成的原發(fā)腎性失鹽性疾病。GS是由SLC12A3 基因失活突變導致，該基因其編碼噻嗪類利尿劑敏感的Na-Cl共同轉運子(NCCT)。SLC12A3基因(MIM 600968)位于染色體16q13,大小約55 kb，包括26個外顯子。NCCT由1 021個或1 030個氨基酸殘基組成，包括12個跨膜部分(S)，一個較大的細胞內N端和一個疏水的C端[1]。以往GS被認為是Bartter綜合征(BS)的一個亞型，且經典型BS同GS表型存在重疊和交叉，故臨床上很容易混淆。同時，研究表明，少數疑似為GS的患者是由CLCNKB基因突變引起[2]，存在遺傳異質性，因此本研究分析對10例GS 患者的SLC12A3和CLCNKB基因，以從分子水平提高對該病的認識。

對象和方法

研究對象 本研究組選取2010年7月至2013年7月青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內科住院治療的10例疑似GS患者，其中男性7例，女性3例，平均年齡(32±13)歲，分別來自9個不同的漢族家系。診斷標準：慢性持續(xù)性低血鉀(<3.5 mmol/L)、低血鎂(<0.65 mmol/L)和低尿鈣(24h尿鈣/尿肌酐<0.1 mmol/mmol)。所有患者均無長期服用緩瀉劑、利尿劑及藥物成癮史。選取100例非相關的健康者作為對照組，評估本研究發(fā)現的新突變位點。本研究獲得青島大學醫(yī)院附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，所有參與者均簽署知情同意書。

研究方法

外周血基因組DNA提取 采用試劑盒(GenElute，Sigma NA2010)抽取患者及其他家庭成員外周血基因組DNA。

引物設計 SLCl2A3基因序列來自Genbank(NC_000016)，采用Primier 5軟件自行設計23對引物擴增SLCl2A3基因全部26個外顯子及其側翼內含子序列[3]。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。根據Simon等[4]的研究設計19對引物擴增CLCNKB基因全部19個外顯子。

PCR產物擴增 在25 μl的反應體系中包含0.2 mmol/L dNTP、0.03 U/ml Taq 聚合酶(DRR006B，大連寶生)、2.0 mmol/L MgCl2、2.5 ml 10X PCR Mg2+free Buffer(Takara)、30 ng基因組DNA以及各1 mmol/L上下游引物。在梯度PCR儀上95℃變性45s，59℃～71℃退火45s，72℃延伸45s，33個循環(huán)后72℃最后延伸10 min。

PCR產物純化和測序 采用磷酸蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化PCR產物，ABI Prism 3700 DNA分析儀(美國Applied Biosystems)進行單向或雙向測序。

DNA測序結果分析 采用Vector NTI11．0與正常序列比對。

為預測可能發(fā)現的錯義突變的致病性 我們引入了錯義突變致病性的評分系統(tǒng)[5-6],并采用Vector NTI advance 10-Align對8種SLC12A3和CLCNKB基因編碼的同源蛋白進行序列比對。

結 果

臨床表現和實驗室檢查結果 10例患者中，9例表現骨骼肌功能障礙(肌肉無力、麻木、搐搦、癱瘓)，1例無癥狀，在查體中發(fā)現低血鉀。5例患者血漿醛固酮水平升高，7例血漿腎素活性升高，10例有低尿鈣(24h尿鈣/尿肌酐<0.1 mmol/mmol)(表1)。

表1 10例患者的臨床表現和實驗室檢查

基因分析 通過直接測序，10例患者中共發(fā)現SLCl2A3基因的9個突變位點可能與GS相關，其中包括7個錯義突變，2個移碼突變。在對照組中未發(fā)現此9個突變。全部突變位點中，6個突變位點(Cys430Gly， Asp486Asn，Ser283Tyr，Thr163Met,Arg913Gln， 2877_2878delAC)已有報道[6-7]；經檢索人類基因突變庫(HGMD)和最近文獻，3個突變位點被證實是本研究發(fā)現的新突變，其中包括2個錯義突變：Glu429Lys，Ala264Gly；1個缺失突變：1740delC(圖1)。所有突變點在NCCT中的位置見圖2。所有患者均未發(fā)現CLCNKB基因的突變。

圖1 新發(fā)現突變位點基因圖譜A：Ala264Gly的野生型；B：Ala264Gly的突變型；C：Glu429Lys的野生型；D：Glu429Lys的突變型；E：1740delC的野生型；F：1740delC的突變型；Ala264Gly中堿基G突變?yōu)锳，編碼的氨基酸相應的由Ala變成Gly；Glu429Lys中堿基G突變?yōu)锳，編碼的氨基酸相應的由Glu變成Lys；而1740delC在1740為缺失堿基C，引起框移突變

圖2 突變點在Na-Cl共同轉運子中的位置示意圖

除1例患者僅發(fā)現1個突變位點外,其余9例患者均存在≥2個突變點，包括純合突變3個，雜合突變6個，攜帶純合突變患者的父母無近親婚配，所有攜帶雜合型突變患者非近親婚配子女。8例患者發(fā)現純合突變Ala264Gly。4例患者攜帶Asp486Asn雜合突變。家系A中，患者6攜帶有雜合突變Glu429Lys和1740delC及純合突變Ala264Gly，但其子例7僅遺傳了父親的雜合突變1740delC和純合突變Ala264Gly，未遺傳雜合突變Glu429Lys。1740delC提前終止于第610位密碼子。例5發(fā)現的2877_2878delAC突變位點已有報道[7-8]，但其報道的為雜合突變，本研究發(fā)現的為純合突變，較為少見(表2)。

對本研究發(fā)現的7個錯義突變位點的致病性分析，P.C430G、p.S283Y和p.T163M存在高致病可能，p.264G和p.D486N中度致病可能，p.E429K和p.R913Q可能不致病(表3)。同源序列比較(Homosapiens (NP_000330.2)、Bos taurus(NP_0￣0￣1￣1￣9￣3￣1￣0￣7.1)、Canis lupus familiaris(XP_535292.3)、Danio rerio(NP_001038545.1)、Gallus gallus(XP_0￣0￣4￣9￣4￣4￣1￣8￣9.1)、Mus musculus(NP_001192240.1)、Rattus norvegicus(NP_062218.3),和Xenopus(Silurana)tropicalis(XP_004913583.1))，顯示NCCT第163、264、430、486位氨基酸在8種生物種均高度保守，283和429分別在6和5種生物中保守。而913位的Arg在其他3種生物中是Gln(圖4)。

表2 10例患者的突變位點

圖3 家系A遺傳圖譜

表3 錯義突變致病性評分

Grantham Matrix評分(括號內)：<60：1分; 61～78.3：2分; 78.4～93.4：3分;>93.4：4分;任何半胱氨酸的替代=5分；多重序列比對評分(MSA評分)(括號內)：8種生物全部保守=5;6～7=4;4～5=3;1～3=1;總分≥8：高致病可能;6～8：中度致病可能;≤5：可能非致病(例如多態(tài)性)

圖4 錯義突變多重序列比對評分(MSA)圖

討 論

GS以低血鉀、低血鎂、低尿鈣、代謝性堿中毒、高腎素-血管緊張素-醛固酮及正?；蚱偷难獕簽樘攸c。其中低尿鈣、低血鎂在臨床上被認為是GS和BS的主要區(qū)別點，但這并非完全可靠[9]。隨著分子遺傳學的發(fā)展，突變基因的發(fā)現，給GS的確診提供了更為可靠的證據。自1996年Simon等[4]從分子角度第一次確認GS的突變基因(SLC12A3)不同于BS(CLCNKB)以來，迄今為止，已經發(fā)現有100多個突變基因與GS有關[10-11]。通過GS致病基因的研究，不僅可以加深對該病的臨床認識及病理生理和分子發(fā)病機制的理解，同時也可以為該病的診斷提供了更為可靠的依據。因此，本研究通過分析10例GS綜合征患者的基因突變情況，以期進一步提高對該病的認識和豐富SLC12A3突變基因庫。

本研究通過直接測序，在10例患者中共發(fā)現SLC12A3基因9個突變位點可能與GS有關，其中3個位于NCCT胞外段(163、429、430)，4個位于胞內段(283、486、913,2877)，2個位于跨膜區(qū)(264，1740)。本研究未發(fā)現突變位點在結構域分布上與疾病之間的關系，與國外文獻一致[12]。在此次發(fā)現的錯義突變中，MSA圖示NCCT第163、264、430、486位氨基酸在8種生物種均高度保守，提示Thr163Met、Ala264Gly、Cys430Gly、Asp486Asn可能均是很有意義的突變；NCCT第283位氨基酸雖然僅在6種物種上同源，但Ser283Tyr錯義突變致病性總評分8分，仍提示高度致病性；對于Arg913Gln和Glu429Lys，雖錯義突變致病性總評分均為4分，且第913位的Arg在其他3種生物中是Gln，因此Arg913Gln和Glu429Lys很可能是多態(tài)性突變。而1740delC和2877_2878delAC均引起框移突變，產生截短的或異常的翻譯產物，對NCCT的結構和功能影響較大，很可能是很有意義的致病性突變。然而，值得指出的是，采用爪蛙卵母細胞、cos-7細胞等生物體，選取以上突變位點，采用蛋白標簽、定點突變等技術，進行功能表達研究較錯義突變致病性的評分系統(tǒng)及基因編碼的同源蛋白進行序列比對更為準確[12]。

本研究大多數患者就診主訴為骨骼肌功能障礙癥狀，如乏力、抽搐甚至癱瘓。但例3卻無明顯癥狀，僅在查體中發(fā)現低鉀。這提示我們，并非所有GS患者均有臨床癥狀。有文獻曾報道一個家系多人攜帶SLC12A3基因中的相同突變，但臨床表現迥異[13-14]。國內學者亦曾對GS的高頻突變基因型和表型的相關性進行研究，結果為無明顯相關性[14]。因此，典型GS表型的出現，可能是多個突變基因協(xié)同作用的結果；同時，后天的環(huán)境、飲食的影響亦不能忽視。10例GS患者，女性僅3例，遠少于男性。歐洲和臺灣學者均發(fā)現[15-16]，男性GS患者較女性癥狀更重，就診率高；同時，動物實驗也證實[17]，正常雌性SD大鼠腎臟表達的NCCT受體的密度是雄性大鼠的2倍，切除卵巢能顯著減少NCCT受體的密度。以上證據均提示性別是導致表型多樣性的因素之一。

有研究顯示，Thr60Met在正常亞洲人群中發(fā)現該突變位點的突變頻率為0.5%～0.8%[15]，而在GS患者中的突變頻率高達33%，推測Thr60Met可能是亞洲人群特有的高發(fā)突變。但本研究卻未發(fā)現該突變點，而突變點Ala264Gly的頻率卻高達38%(8/21),考慮可能原因為本研究所涉及樣本量較少,與相對較大的樣本比較，結果存在偏差。

既往文獻報道，高達40%左右的GS患者僅發(fā)現1個突變位點[16],可能原因有：(1)突變位點可能位于SLCl2 A3基因的調節(jié)序列或內含子的深部，而上述兩部分平時不予測序分析；(2)包含1個或多個外顯子的基因片斷重排后難以通過單個外顯子分析的方法確定；(3)突變可能位于其他調節(jié)NCCT功能的基因，如WNKl，WNK4等[15]。雖然未針對上述可能原因在基因測序方面做相應改進，但本研究中僅10%(1/10)的患者存在一個突變位點，遠遠低于文獻報道，考慮可能原因為本研究樣本量較 2個突 S為一種常染色體隱性遺傳病，根據遺傳定律，除非是近親結婚或者婚配同樣的患者，一個家系連續(xù)兩代均出現患者極為罕見[18]。但本研究中，家系A中父子2人均為GS患者。追問婚姻史，例7父母并非近親結婚。由此推測，例6的配偶有可能也是GS患者，因無癥狀而未就診；而例7患者攜帶的純合突變Ala264Gly其中之一即來自其母親。因此，這似乎從一定程度上說明，GS并非罕見病，其發(fā)病率可能遠遠大于既往文獻報道。同時，Ala264Gly可能確為本區(qū)域GS的熱點突變。

綜上所述，通過直接測序，我們共發(fā)現GS致病基因SLCl2A3的9個突變位點，其中3個為新突變位點；典型GS表型的出現，可能是多個突變基因協(xié)同作用的結果；通過GS致病基因的研究，不僅可以加深對該病的分子發(fā)病機制的理解，同時也可以為該病的診斷提供更為可靠的依據。

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(本文編輯 春 江)

Analysis of SlCl2A3 gene mutation in patients with Gitelman syndrome

WANGYan1,HANZhengbin1,SHAOLeping2，LUANJian1,LIUJun3

DepartmentofNephrology,theAffiliatedHospitalofMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,China2DepartmentofEndocrinology,theQingdaoMunicipalHospital(Group),Qingdao266003,China3DepartmentofNephrology,theQingdaoNO.8people’shospital,Qingdao266003,China

Objective：To identify the new mutations of SLCl2A3 and CLCNKB gene in patients with suspicious Gitelman syndrome, and Analyze the characteristics of the genetic mutations． Methodology：Ten patients hospitalized in the affiliated hospital of Qingdao university with the clinical and biochemical features of Gitelman syndrome were analyzed by direct sequencing of SLCl2A3 gene．One hundred unrelated normal subjects were selected to evaluate all the mutations found by this study and make sure that they are new mutations through the Human Gene Mutation date base． Results：Nine mutations were identified in SLCl2A3 gene of 10 patients with Gitelman syndrome. Four were novel variants, including 2 missense mutations：Glu429Lys, Ala264Gly, and one deletions：1740delC. Six were recurrent ones including 5 missense mutations: Cys430Gly, Asp486Asn, Ser283Tyr, Thr163Met, Arg913Gln; and one deletion: 2877_2878delAC. The Homozygous mutation Ala264Gly was found in 8 of 10 patients while the heterozygous mutation Asp486Asn in 4 of 10．The majority of the patients were compound heterozygous. Conclusion：Nine mutations were identified in SLCl2A3 gene of 10 patients with Gitelman syndrome, and 3 were novel variants.

Gitelman syndrome Mutation SLCl2A3 gene

山東省科技廳基金(2011GSF11832)

1青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內科(青島，266003)；2青島市市立醫(yī)院(集團)內分泌科；3青島市第八人民醫(yī)院腎內科

? 2015年版權歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有

2015-03-17