家蠅幼蟲溶菌酶II基因的克隆、表達(dá)及抑菌活性研究

邵清，唐艷，萬玲，孔令聰，裴志花，馬紅霞，2?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)科技學(xué)院，長春130118；2.動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118）

家蠅幼蟲溶菌酶II基因的克隆、表達(dá)及抑菌活性研究

邵清1，唐艷1，萬玲1，孔令聰1，裴志花1，馬紅霞1，2?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)科技學(xué)院，長春130118；2.動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118）

以本實驗室構(gòu)建的雞致病性大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲抑制性消減雜交文庫（SSH）為基礎(chǔ)，對家蠅幼蟲溶菌酶II基因（MdL－II）進(jìn)行克隆，得到全長為532 bp的cDNA片段，其開放閱讀框（ORF）與GenBank中登錄號為HQ897688.1的MdL－II基因全序列同源性為95%。將MdL－IIORF序列插入到pET－32a（＋）表達(dá)載體中成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析，結(jié)果顯示約在34 ku處出現(xiàn)表達(dá)條帶且與目的蛋白大小相符。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG濃度為0.6 mmol／L時可獲得大量可溶性Trx－MdL－II融合蛋白，純化融合蛋白并進(jìn)一步檢測該蛋白的抑菌活性，結(jié)果表明融合蛋白對大腸桿菌和鏈球菌均有抑菌作用，且對大腸桿菌的抑菌作用相對較強(qiáng)。

家蠅幼蟲；家蠅溶菌酶II基因；克隆表達(dá)；蛋白純化

溶菌酶作為抗菌肽家族中的一員，在抵抗病原微生物方面發(fā)揮著舉足輕重的作用［1－2］。相關(guān)研究表明，溶菌酶基因可在經(jīng)病原微生物刺激的家蠅幼蟲腸內(nèi)和脂肪內(nèi)高效表達(dá)［3］，從而殺滅入侵的病原微生物起到保護(hù)自身不受傷害的作用，這也是家蠅幼蟲能長期生存在惡劣環(huán)境中而自身不感染病原菌的主要原因之一，其抗菌機(jī)理可能是通過消化細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層水解N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖之間的β－1，4糖苷鍵來破壞微生物細(xì)胞壁使細(xì)胞失去保護(hù)而裂解凋亡［4］。本研究以雞致病性大腸桿菌誘導(dǎo)三日齡家蠅幼蟲后構(gòu)建的家蠅幼蟲抑制性消減雜交文庫（SSH）為基礎(chǔ)，對篩選出的差異基因家蠅幼蟲溶菌酶II基因（Musca domestica lysozyme－II，MdL－II）進(jìn)行克隆表達(dá)，并對純化產(chǎn)物進(jìn)行活性檢測，以期為進(jìn)一步研究Trx－MdL－II融合蛋白的相關(guān)活性及構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SSH文庫、受體菌和表達(dá)載體 以臨床分離獲得的雞腸道致病性大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅3日齡幼蟲后構(gòu)建的SSH文庫，3’和5’－RACE Ready cDNA由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實驗室成員完成［5］。感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α、感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET－32a（＋）均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 SMARTTMRACE cDNA Amplifica?tion，Clontech Laboratories，Inc公司。Ex TaqTMDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Xho I、Bam H I、Hin d III、pMD18－T載體試劑盒、DL 2000DNA Marker、λ－Hin d III digest DNA Marker、T4 DNA Ligase，大連寶生物工程有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。異丙硫代β－D半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（AMP），自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。瓊脂糖、DTT（二硫蘇糖醇）、TEMED（四甲基乙二胺）、尿素、Imidazole（咪唑），Sigma公司。His TrapTMFF crude預(yù)裝柱，瑞典GE healthcare公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物合成及DNA測序 引物合成及重組質(zhì)粒的測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅幼蟲溶菌酶II基因的cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE） 針對SSH文庫中篩選獲得的MdL－II基因cDNA序列設(shè)計特異性引物。利用Primer5.0軟件根據(jù)SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書中設(shè)計特異性引物的原則設(shè)計3’RACE和5’RACE特異性引物如下GSP2：5’－GCACTCATCG?TAGGAGAAGGCACC－3’；GSP1：5’－GGCTCTCGCGAC?TATGGTATCTTCC－3’。將特異性引物送由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增3’RACE和5’RACE由本實驗室成員獨(dú)立完成。RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD18－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將酶切驗證為陽性的重組質(zhì)粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。

1.2.2 MdL－II基因開放閱讀框的擴(kuò)增 將測序成功后得到的5’和3’末端序列利用DNAMAN軟件拼接獲得MdL－II基因的全長cDNA序列。運(yùn)用在線網(wǎng)站http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html尋找該序列的ORF序列。利用Primer5.0軟件對該ORF序列設(shè)計特異性引物MdL－IIF和MdL－IIR如下：MdL－IIF，5’－TAGGATCC ATGTTCAAATTCACC－3’（含Bam H I酶切位點）；MdL－IIR，5’－CACTC?GAGTTAGAAGCAATCATCA－3’（含XhoⅠ酶切位點）。

以家蠅幼蟲5’－RACE－Ready cDNA為模板對MdL－II基因ORF序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物并純化后與pMD18－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證為陽性后，將重組質(zhì)粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。將該重組質(zhì)粒命名為pMD18－T－MdL－II。

1.2.3 MdL－II基因ORF序列的測定及序列同源性分析 運(yùn)用NCBI網(wǎng)站http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi對MdL－II基因ORF序列進(jìn)行BLASTN分析。運(yùn)用DNAMAN軟件分析MdL－II基因ORF序列與已知溶菌酶基因序列的同源性。

1.2.4 MdL－II基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET－32a（＋）與重組質(zhì)粒pMD18－TMdL－II進(jìn)行Bam H I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收MdL－II目的基因和pET－32a（＋）原核表達(dá)載體。將MdL－II目的基因與pET－32a（＋）原核表達(dá)載體連接過夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，將獲得的陽性重組質(zhì)粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。將重組質(zhì)粒命名為pET－32a－MdL－II。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET－32a－MdL－II表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析 將測序成功的重組陽性質(zhì)粒pET－32a－MdL－II轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，參照文獻(xiàn)［6］的方法挑取單克隆菌落接種于含5μLAmp的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃150 r／min振蕩培養(yǎng)過夜后取3 mL菌液接種于300 mL液體LB培養(yǎng)基中，監(jiān)測菌液OD600值在0.6～0.8之間時，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的菌液經(jīng)TE反復(fù)吹洗2次后，冰浴超聲波破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。

1.2.6 重組質(zhì)粒pET－32a－MdL－II表達(dá)條件的優(yōu)化挑取含有重組質(zhì)粒pET－32a－MdL－II的單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)，檢測目的基因在誘導(dǎo)劑（IPTG）濃度和誘導(dǎo)溫度不同時表達(dá)水平的變化。參照文獻(xiàn)［6］的方法針對起始濃度（OD600為0.7）、誘導(dǎo)時間（6 h）和誘導(dǎo)溫度（37℃）相同的菌液變化IPTG終濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol／L觀察其表達(dá)水平的變化；對起始濃度（OD600為0.7）、誘導(dǎo)時間（6 h）和IPTG終濃度（0.6 mmol／L）相同的菌液變化誘導(dǎo)溫度10、20、28、37℃觀察其表達(dá)水平的變化。對上述試驗菌液各取1mL進(jìn)行SDS－PAGE電泳，分析目的蛋白的表達(dá)量從而確定重組質(zhì)粒pET－32a－MdL－II的最佳表達(dá)條件。

1.2.7 Trx－MdL－II融合蛋白的親和純化 收集最優(yōu)誘導(dǎo)條件下表達(dá)的菌液，以TE（pH 8.0）緩沖液反復(fù)洗滌菌體2次，冰浴超聲波破碎菌體后，4℃12000 r／min離心30 min。取超生破碎后的上清液進(jìn)行親和純化，操作過程參照GE healthcare的His TrapTMHP說明書進(jìn)行。

1.2.8 Trx－MdL－II融合蛋白抑菌活性檢測 用超濾管將純化獲得的融合蛋白進(jìn)行濃縮，采用牛津杯法檢測融合蛋白的抑菌活性［7］。取100μL菌液（105CFU／mL）均勻涂布于LB平板上，放入牛津杯，杯內(nèi)加入100μLTrx－MdL－II融合蛋白，37℃培養(yǎng)12 h，觀察有無抑菌環(huán)出現(xiàn)，并測量抑菌環(huán)大小。

2 結(jié)果

2.1 MdL－II基因的cDNA末端快速擴(kuò)增 用MdL－II基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），將3’與5’擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pMD18－T克隆載體連接，提質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（Xho I，Hin d III）驗證為陽性后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析，獲得一條411 bp的3’端片段（圖2），獲得一條362 bp的5’端片段（圖3），利用DNA軟件進(jìn)行拼接得到大小為532 bp的全長序列。

圖1 MdL－II基因的RACE擴(kuò)增結(jié)果

圖2 MdL－II基因3’重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

圖3 MdL－II基因5’重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.2 全長基因的PCR擴(kuò)增 用MdL－II基因的全長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一條約為429 bp的片段（圖4）。pMD18－T－MdL－II重組質(zhì)粒雙酶切驗證顯示，獲得的條帶與429 bp大小相符（圖5），證明克隆載體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 MdL－II全長基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖5 pMD18－T－M dL－II重組質(zhì)粒的雙酶切驗證

2.3 MdL－II基因ORF序列的測定及序列同源性分析 MdL－II基因ORF片段長度為429 bp，運(yùn)用NCBI網(wǎng)站對MdL－II全長基因序列進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果顯示MdL－II基因與Genbank中登錄號為HQ897688.1的家蠅溶菌酶II基因全序列同源性為95%，氨基酸序列同源性為97%，且差異氨基酸散在分布于氨基酸序列當(dāng)中。此外，MdL－II基因與登錄號為AY344588.1的家蠅富含賴氨酸的溶菌酶2基因序列同源性為93%，與登錄號為AY344589.1的家蠅溶菌酶1基因序列同源性為74%。

2.4 pET－32a－MdL－II重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pET－32a－

MdL－II重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證后，獲得大小約為429 bp和5900 bp的片段（圖6），分別為MdL－II全長基因目的片段和pET－32a（＋）表達(dá)載體，表明pET－32a－MdL－II原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.5 MdL－II基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析分別誘導(dǎo)帶有pET－32a（＋）空載體質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）菌液和帶有pET－32a－MdL－II重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）菌液表達(dá)，取誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE分析。結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌液在約34 ku大小處出現(xiàn)表達(dá)條帶，與預(yù)期表達(dá)蛋白大小相符（圖7）。對重組菌進(jìn)行冰浴超聲破碎，電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白大部分存在于上清液中，在沉淀中含量較少，屬于可溶性表達(dá)（圖8）。

圖6 pET－32a－MdL－II重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖7 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物PAGE電泳

圖8 融合蛋白在上清和沉淀中表達(dá)量的對比

2.6 重組質(zhì)粒pET－32a－MdL－II表達(dá)條件的優(yōu)化分別采用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，各取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析（圖9），結(jié)果表明當(dāng)IPTG濃度為0.6 mmol／L時融合蛋白獲得高效表達(dá)。在IPTG濃度為0.6 mmol／L條件下，分別采用10、20、28、37℃進(jìn)行誘導(dǎo)，各取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析（圖10），結(jié)果顯示當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時融合蛋白表達(dá)量較大。

2.7 Trx－MdL－II融合蛋白的純化 采用鎳離子親和層析方法純化經(jīng)超聲破碎后含有目的蛋白的上清液。SDS－PAGE結(jié)果顯示，140 mM的咪唑洗脫液中含有分子量約為34 ku的融合蛋白目的條帶（圖11）。

2.8 Trx－MdL－II融合蛋白的抑菌活性檢測 大量收集純化后的融合蛋白并以超濾管濃縮后得到濃度為2.312 mg／mL的融合蛋白。以洗脫液為對照與濃縮后的融合蛋白進(jìn)行抑菌效果的比較（圖12－圖13）。

圖9 不同濃度IPTG誘導(dǎo)下融合蛋白表達(dá)量分析

圖10 不同誘導(dǎo)溫度下融合蛋白表達(dá)量分析

圖11 Trx－MdL－II融合蛋白的純化產(chǎn)物

圖12 融合蛋白對鏈球菌的抑菌實驗

濃縮后的融合蛋白對鏈球菌和大腸桿菌均有抑菌環(huán)出現(xiàn)，融合蛋白對鏈球菌的抑菌環(huán)直徑為7 mm，對大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑為16 mm，而洗脫液沒有抑菌環(huán)出現(xiàn)，說明融合蛋白對鏈球菌和大腸桿菌均有抑菌作用。

3 討論

在微生物的誘導(dǎo)刺激下家蠅可通過部分基因的選擇性表達(dá)對自身免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，以合成的一系列免疫活性物質(zhì)對異物的侵襲進(jìn)行抵御［8］。相關(guān)研究表明與家蠅免疫防御功能相關(guān)的基因包括：防御素基因、攻擊素基因、天蠶素基因、溶菌酶基因、肽聚糖識別蛋白基因、金屬硫蛋白基因、熱休克蛋白70基因等［9－10］，這些基因均與家蠅免疫反應(yīng)休戚相關(guān)。近年來，隨著人們對家蠅免疫基因進(jìn)行深入研究，溶菌酶做為抗菌肽的主要成員已逐步受到了人們的高度重視。

研究人員在對溶菌酶的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)不同來源的溶菌酶抑菌活性各不相同，并且具有較廣的抗菌譜。相關(guān)研究報道重組海參溶菌酶C端基因（SjLys－C）的表達(dá)產(chǎn)物對溶壁微球菌和副溶血弧菌有較高的抑菌活性［11］。趙燕靜等［12］發(fā)現(xiàn)天然三倍體淇河鯽不同組織器官中的溶菌酶抑菌活性存在差異，對霍亂弧菌的抑制作用最強(qiáng)的為肝胰臟和腎臟中的溶菌酶。宋佳［13］以3種微生物（大腸桿菌、蛹蟲草菌及柞蠶微孢子蟲）誘導(dǎo)柞蠶蛹后，研究免疫血淋巴的抑菌作用結(jié)果顯示3個處理組的柞蠶踴血淋巴中提取的溶菌酶對溶壁微球菌所產(chǎn)生的抑菌圈直徑均在14－22 mm之間。王梅梅等［14］成功構(gòu)建了pET－32a－MdL－1原核表達(dá)載體，并對其融合蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示溶菌酶融合蛋白對雞致病性大腸桿菌有抑菌活性。

本試驗對MdL－II差異基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，該基因與王梅梅等克隆的家蠅溶菌酶1基因序列同源性為68%，氨基酸序列同源性為73%，為進(jìn)一步研究MdL－II差異基因的生物學(xué)活性，本實驗構(gòu)建了pET－32a（＋）－MdL－II表達(dá)載體，探索了不同濃度IPTG對Trx－MdL－II融合蛋白表達(dá)量的影響，進(jìn)而對融合蛋白的體外抑菌活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，選用濃度為0.6 mmol／L的IPTG時融合蛋白表達(dá)量較高并多以可溶蛋白的形式存在于裂解液上清中；融合蛋白對大腸桿菌和鏈球菌均有抑菌作用，且對大腸桿菌的抑菌活性明顯高于家蠅溶菌酶1基因的表達(dá)產(chǎn)物，因此，Trx－MdL－II融合蛋白在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)中具有潛在應(yīng)用和開發(fā)價值。

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（編輯：陳希）

Cloning and Prokaryotic Expression of the Lysozyme IIGene from Musca domestica Larvae

SHAO Qing1，TANG Yan1，WAN Ling1，KONG Ling－cong1，PEIZhi－h(huán)ua1，MA Hong－xia1，2?
（1.College of AnimalScience and Technology，Jilin Agriculural University，Changchun 130118，China；2.Animal Production＆Product Quality and Security，Ministry ofEducation，Changchun 130118，China）

The experiment was based on the suppression subtractive hybridization library（SSH）induced by Pathogenic Escherichia coli of chicken which constructed by Animal Pharmacology and Toxicology Laboratory.Amplify Md－lysozyme IIgene’sfull－length cDNA，then sequencing analysis showed that the full－length cDNA of Md－lysozyme II gene was 532 bp，in size，the homology of the open reading frame cDNA sequence with the Md－lysozyme II（HQ897688.1）from GenBank is up to 95%.The Md－lysozyme IIgene was ligated into expression vector pET－32a（＋）.The recombinant protein was verified by SDS－PAGE，the results showed that the recombinant protein was about 34 ku and consistent with the size of the target protein.When the induction temperature was 37℃and the concentration of IPTG was 0.6 mmol／L we could get a large amount of soluble Trx－MdL－IIrecombinant protein..In order to obtain high purity recombinant protein we used nickel ion affinity chromatography to purify Trx－MdL－II recombinant protein.While the recombinant protein could inhibit the growth of Escherichia coli and Streptococcus，the inhibitory effect on Escherichia coli was relatively stronger than on Streptococcus.Key words：Musca domestica larvae；Md－lysozyme II；cloning and expression；protein purification

2014－11－25

A

1002－1280（2015）02－0001－06

S852.6

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項目（NCET－10－0174）；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目（2011－Y05）；吉林省科技廳項目（20111820）

邵清，碩士研究生，從事動物藥理與毒理學(xué)方面研究。

馬紅霞。E－mail：hongxia0731001＠163.com