羅紅霉素對哮喘平滑肌細胞增殖以及微囊蛋白-1及PI3K/Akt的影響

徐 慧,戴元榮，李鳳琴，付玉茹，夏夢玲，葛翔挺

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸科， 浙江 溫州 325027)

羅紅霉素對哮喘平滑肌細胞增殖以及微囊蛋白-1及PI3K/Akt的影響

徐 慧,戴元榮，李鳳琴，付玉茹，夏夢玲，葛翔挺

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸科， 浙江 溫州 325027)

目的 研究羅紅霉素(RXM)能否通過上調(diào)微囊蛋白-1(caveolin-1)的表達來調(diào)控PI3K/Akt通路，從而抑制TGF-β1刺激引起的哮喘氣道平滑肌細胞(ASMCs)增殖。方法 30只健康♂ SD大鼠隨機分為對照組和哮喘組，每組15只，以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立大鼠哮喘模型。將培養(yǎng)的ASMCs進行鑒定后，在哮喘組細胞中分別加入TGF-β1、PI3K/Akt通路抑制劑渥曼寧青霉素(wortmannin)、膽固醇剔除劑β-環(huán)糊精(β-CD)以及RXM進行干預(yù)，后三組在干預(yù)后再用TGF-β1刺激，故分6組：①TGF-β1組、②哮喘組、③正常組、④wortmannin+TGF-β1 組、⑤β-CD+TGF-β1組、⑥RXM+TGF-β1組，用CCK-8法檢測哮喘大鼠ASMCs的增殖，Western blot檢測ASMCs上caveolin-1、Akt 、p-Akt的表達情況。結(jié)果 ①TGF-β1組較正常組和哮喘組細胞增殖明顯(P<0.01，P<0.05)；RXM 和wortmannin干預(yù)組較TGF-β1組細胞增殖減少(均P<0.01)。②與正常組比較，哮喘組、TGF-β1組、β-CD干預(yù)組氣道平滑肌細胞caveolin-1的表達量明顯減少(均P<0.05)，TGF-β1組較哮喘組caveolin-1表達量明顯減少(P<0.05)；與此同時，哮喘組ASMCs較正常組p-Akt的表達量明顯增加(P<0.05)，TGF-β1組較哮喘組p-Akt表達量明顯增加(P<0.05)，wortmannin干預(yù)組較TGF-β1組p-Akt的表達量明顯減少，β-CD干預(yù)組較TGF-β1組p-Akt表達量明顯增加(P<0.05)，RXM干預(yù)組較TGF-β1組p-Akt表達量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 羅紅霉素可抑制TGF-β1刺激導(dǎo)致的哮喘大鼠ASMCs的增殖，并上調(diào)caveolin-1表達，抑制p-Akt活化。

羅紅霉素；微囊蛋白；磷脂酰肌醇3激酶；氣道平滑肌細胞；哮喘；氣道重塑

氣道重塑是支氣管哮喘(簡稱哮喘)發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)之一，是難治性哮喘的重要因素，其中氣道平滑肌細胞(ASMCs)的增殖發(fā)揮了重要作用[1]。羅紅霉素(roxithromycin,RXM)是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，經(jīng)藥理研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除了抗菌作用外，還具有較強的抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)微囊蛋白-1(caveolin-1)信號通路的激活可能參與氣道重構(gòu)相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制哮喘支氣管ASMCs[3]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑是介導(dǎo)ASMCs增殖的一條重要通路。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號途徑在哮喘發(fā)病中起著重要作用[4]。所以本實驗通過建立哮喘模型，使用RXM進行干預(yù)，探討RXM能否抑制TGF-β1刺激導(dǎo)致的哮喘大鼠ASMCs的增殖，并上調(diào)caveolin-1表達，抑制p-Akt活化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 SPF級♂SD大鼠30只(溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供)，實驗動物許可證SYXK(浙)2010-0150，體質(zhì)量100～120 g,6～8周齡。隨機分為對照組和哮喘組(n=15)。

1.1.2 主要試劑 優(yōu)級胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素-鏈霉素溶液(江蘇碧云天生物工程有限公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁生化研究所)，羅紅霉素粉劑、SMα-actin單克隆抗體(Sigma公司，美國)，GAPDH抗體、胰酶細胞消化液(江蘇碧云天生物工程有限公司)，caveolin-1 抗體、p-Akt抗體(Abcam公司，美國)，RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的制備 復(fù)制慢性哮喘模型[5],分致敏和激發(fā)2階段。哮喘組分別于d 1和d 8大鼠腹腔注射1 mL OVA/Al(OH)3混合液[內(nèi)含1 mg OVA和100 mg Al(OH)3]致敏，d 15開始激發(fā)，將大鼠置于特制玻璃容器內(nèi)，霧化吸入含1%OVA的生理鹽水8 mL，隔天1次，每次30 min，共8周；對照組用生理鹽水代替OVA進行致敏和激發(fā)。

1.2.2 肺組織的HE染色 大鼠經(jīng)末次激發(fā)后處死，結(jié)扎并游離右肺下葉，將其浸入4%的多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋，做病理切片。制備好的切片做HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3 氣道平滑肌細胞的培養(yǎng)和鑒定 培養(yǎng)正常組和哮喘組大鼠支氣管ASMCs，ASMCs細胞通過倒置顯微鏡形態(tài)學觀察，并經(jīng)SMα-actin 抗體, SABC 免疫組化法進行鑒定。采用改良組織貼塊法培養(yǎng)原代ASMCs，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),細胞貼壁生長。加入胰酶細胞消化液進行消化，并采用差速貼壁法純化細胞，傳代細胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng), 按1 ∶2～3傳代，取第3～6代細胞進行實驗。

細胞免疫組化法步驟如下：將ASMCs爬片漂洗固定，0.3%Triton-×100作用20 min，漂洗，3%H2O2孵育后加正常山羊血清，37℃孵育30 min，不洗，滴加小鼠SMα-actin(1 ∶200)單克隆抗體，4℃過夜，加生物素化山羊抗小鼠IgG，孵育后加HRP標記鏈親和素，再加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片后顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞增殖 取3～6代細胞，消化、離心后，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基將細胞調(diào)至濃度為4×106～5×106·L-1的混懸液，然后接種于96孔板，每孔100 μL，待細胞80%～90%融合后，換無血清RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0期，換用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。哮喘組平滑肌細胞分別用TGF-β1、PI3K/Akt通路抑制劑wortmannin、膽固醇剔除劑β-環(huán)糊精(β-CD)、RXM進行干預(yù)，后3組藥物干預(yù)后再用TGF-β1刺激，觀察平滑肌細胞增殖情況。故細胞隨機分為6組：①TGF-β1組、②哮喘組、③正常組、④wortmannin+TGF-β1 組、⑤β-CD+TGF-β1組、⑥RXM+TGF-β1組，其中β-CD作用是破壞caveolae的結(jié)構(gòu)，減少caveolin-1的表達。以上藥物所用的終濃度分別為TGF-β1(10 μg·L-1)、wortmannin(10 nmol·L-1)、β-CD(10 mmol·L-1)、羅紅霉素(100 mg·L-1)[6-7]。

用CCK8法檢測細胞增殖步驟如下：① 接種細胞于96孔板；② 細胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)及分組如上述；③ 顯色：培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入CCK-8溶液培養(yǎng)2 h；④用酶標儀檢測在450 nm處各孔的吸光度。

1.2.5 電鏡下觀察caveolae的結(jié)構(gòu) 取3～8代哮喘模型大鼠ASMCs，經(jīng)純化傳代，細胞長至達到80%左右密度。取正常組和哮喘組細胞于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)孵育48 h后,離心,細胞戊二醛固定后，送電鏡室進一步處理,觀察各組細胞膜表面caveolae變化情況。

1.2.6 Western blot檢測大鼠ASMCs中caveolin-1、p-Akt蛋白的表達 提取細胞總蛋白，將樣本稀釋、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，在5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h后洗膜，分別加兔抗大鼠caveolin-1抗體(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶800)及小鼠抗大鼠GAPDH抗體(1 ∶5 000)孵育，4℃冰箱過夜搖床孵育，洗膜；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)及山羊抗小鼠二抗(1 ∶3 000)，最后ECL試劑盒顯色，掃描、顯影、洗像。每組實驗均重復(fù)3次。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間差異比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化光鏡顯示哮喘組黏膜下、支氣管及血管周圍大量炎癥細胞浸潤，氣道上皮黏液腺增生，支氣管壁明顯增厚、管腔狹窄，嗜酸粒細胞增多，見Fig 1。

Fig 1 Pathology of different groups (×400)

A: Control group;B: Asthma group

2.2 ASMCs鑒定① 倒置相差顯微鏡觀察，ASMCs未匯合前多呈梭形或多邊形，匯合后部分區(qū)域細胞束狀排列，起伏狀生長，呈典型“峰谷”生長狀態(tài)。② 免疫細胞化學鑒定：SMα-actin免疫細胞化學染色后，結(jié)果顯示α-肌動蛋白呈橘黃色絲狀物,鑒定為哮喘大鼠ASMCs，見Fig 2。

Fig 2 Identification of ASMCs

A:Immunochemical staining of ASMCs(×200);B: Observation of ASMCs under inverted microscope (×100)

2.3 電鏡下觀察caveolae形態(tài)透射電鏡放大12 000倍觀察哮喘大鼠ASMCs可見到細胞表面的caveolae結(jié)構(gòu)。正常組caveolae含量豐富，哮喘組caveolae結(jié)構(gòu)破壞。見Fig 3。

Fig 3 Observation of caveolae in ASMCs by scanning electron microscope (×7 000)

A: Control group;B:Asthma group.

2.4 CCK-8法測各組細胞增殖情況TGF-β1組與正常組、哮喘組比較,OD值均明顯增加(P<0.01,P<0.05)；與TGF-β1組相比，RXM+TGF-β1組OD值下降(P<0.05)，見Tab 1。

GroupOD/%TGF-β1140.3#Asthma100.0Normal53.8**Wortmannin+TGF-β186.5**β-CD+TGF-β1178.8*RXM+TGF-β1109.6*

#P<0.05vsasthma group;*P<0.05,**P<0.01vsTGF-β1 group

2.5 Western blot檢測結(jié)果p-Akt蛋白的表達在哮喘組增加，TGF-β1組較哮喘組p-Akt表達量明顯增加，而用抑制劑wortmannin后p-Akt的活化明顯降低，羅紅霉素可以明顯抑制p-Akt的活化。Caveolin-1在哮喘組和TGF-β1組表達量較正常組降低，經(jīng)β-CD干預(yù)后表達明顯降低，經(jīng)羅紅霉素干預(yù)后較TGF-β1組表達量增高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Fig 4。

3 討論

研究表明大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除了具有抑制炎癥、控制免疫反應(yīng)等作用外，還能抑制ASMCs的增殖，從而調(diào)控氣道重塑的發(fā)生[8]。本課題組前期的實驗結(jié)果已表明，在光鏡下哮喘組與正常組大鼠支氣管基底膜周徑差異無統(tǒng)計學意義，管壁總面積、平滑肌面積具有可比性。哮喘組管壁厚度(μm2/μm)、平滑肌厚度(μm2/μm)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義[9]。本研究哮喘組ASMCs加用RXM干預(yù)后增殖明顯減少，提示RXM可能存在抑制ASMCs增殖的作用，那這種作用是通過何種途徑實現(xiàn)的呢？

Fig 4 Expressions of caveolin-1 and p-Akt in ASMCs by Western blot

A:TGF-β1 group；B:Asthma group；C: Normal group；D: Wortmannin+TGF-β1 group；E: β-CD+TGF-β1 group； F: RXM+TGF-β1 group.*P<0.05vsTGF-β1 group

Caveolin-1可以減少氣道ASMCs的生長、負性調(diào)節(jié)氣道平滑肌增殖[10]。TGF-β1 被認為是致氣道重塑的主要介質(zhì)，它通過調(diào)節(jié)ASMCs遷移及增生等多種途徑參與哮喘的發(fā)病過程[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，用TGF-β1刺激哮喘ASMCs增殖的過程中，caveolin-1的表達量明顯減少，故進一步推測caveolin-1可能在TGF-β1誘導(dǎo)哮喘ASMCs增殖的過程中起著負性調(diào)控作用。在本研究中哮喘組ASMCs中加入β-CD破壞caveolae的結(jié)構(gòu)，減少caveolin-1的表達，再用TGF-β1刺激，發(fā)現(xiàn)ASMCs增殖明顯增加，證實了caveolin-1在TGF-β1誘導(dǎo)哮喘ASMCs增殖的過程中發(fā)揮了負性調(diào)控的作用。在RXM干預(yù)組發(fā)現(xiàn)caveolin-1表達明顯增加，ASMCs增殖減少，推測羅紅霉素能抑制ASMCs的增殖，可能與上調(diào)caveolin-1的表達有關(guān)。

Park等[12]實驗中發(fā)現(xiàn)，細胞膜上的caveolin-1的活化可激活PI3K/Akt 通路,而且有研究發(fā)現(xiàn)敲除caveolin-1基因可減少TGF-β介導(dǎo)的Akt的磷酸化[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)TGF-β1組ASMCs增殖的過程中，p-Akt的表達量增加，用β-CD干預(yù)破壞caveolin-1后，p-Akt表達量較TGF-β1組增加更為明顯， ASMCs的增殖也更為明顯，RXM干預(yù)后，p-Akt表達量下降，ASMCs增殖減少。所以本研究提示RXM減少ASMCs增殖可能與上調(diào)caveolin-1，抑制p-Akt活化有關(guān)。

此外caveolae作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中心可能調(diào)控較多的信號通路，它們之間是否存在交叉對話，共同調(diào)控ASMCs增殖，這些將有待我們進一步的研究。

總之，RXM可能抑制TGF-β1刺激導(dǎo)致的哮喘大鼠ASMCs的增殖，并上調(diào)caveolin-1表達，抑制p-Akt活化。本實驗從動物實驗方面對RXM調(diào)控ASMCs增殖的機制進行了探索，為哮喘的防治提供了新策略、開辟了新途徑。

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Effect of roxithromycin on asthma smooth muscle cells proliferation,caveolin-1 and PI3K/Akt pathway

XU Hui, DAI Yuan-rong, LI Feng-qin,FU Yu-ru, XIA Meng-ling,GE Xiang-ting

(DeptofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,WenzhouZhejiang325027,China)

Aim To investigate the effect of roxithromycin(RXM) on TGF-β1 induced airway smooth muscle cells(ASMCs) proliferation of asthmatic rats via caveolin-1 and PI3K/Akt pathway.Methods Thirty male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into the normal group and the asthma group. Rat models of chronic asthma were prepared and rats ASMCs were culturedinvitro. The asthmatic ASMCs with TGF-β1, wortmannin (inhibitor of PI3K/Akt pathway), β-cyclodextrin (cholesterol elimination agent)and RXM were interfered.The last three groups were stimulated with TGF-β1.The cells were divided into:①TGF-β1 group,②asthma group,③normal group,④wortmannin+TGF-β1 group, ⑤β-CD+TGF-β1 group,⑥RXM+TGF-β1 group. Cells proliferation in each group was detected respectively with CCK8 method， and the expressions of caveolin-1 and p-Akt protein were detected with Western blot. Results The proliferation of ASMCs in TGF-β1 group increased significantly compared with that in normal group and asthma group(P<0.01，P<0.05).While the ASMCs in the TGF-β1+ wortmannin group, RXM+TGF-β1 group decreased significantly compared with those in TGF-β1 group(P<0.01).The expression of caveolin-1 in ASMCs of asthmatic group,TGF-β1 group, β-CD+TGF-β1 group decreased significantly compared with that in the normal group(P<0.05), and that in TGF-β1 group was less than in asthma group(P<0.05). The expression of p-Akt in ASMCs of asthma group increased significantly compared with that in normal group(P<0.05), and that in TGF-β1 group increased more than that in asthma group(P<0.05),while that in β-CD+TGF-β1 group increased more than that in TGF-β1 group. The expression of p-Akt in RXM+TGF-β1 group was less than that in TGF-β1 group. Conclusion RXM may supress TGF-β1-induced ASMCs proliferation in asthmatic rats, increase the expression of caveolin-1,and depress the activation of p-Akt.

roxithromycin；caveolin-1；PI3K；smooth muscle cells；asthma;airway remodeling

時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.022.html

2014-10-13,

2014-12-28

浙江省自然科學基金資助項目(No Y2080466)；溫州市科技局項目(No Y20130351)

徐 慧(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：支氣管哮喘發(fā)病機制，Tel:0577-88002714,E-mail：xh_tomy@163.com; 戴元榮(1963-)，男，碩士，教授，研究方向：支氣管哮喘發(fā)病機制，通訊作者，Tel:0577-88002714,E-mail：daiyr@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.022

A

1001-1978(2015)03-0407-05

R-332；R322.74；R329.24；R562.25；R978.15