小劑量多巴胺對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制*

蔡曉娜， 時 颯， 李鴻珠， 王麗娜， 張 力， 李 弘

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086)

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小劑量多巴胺對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制*

蔡曉娜， 時 颯， 李鴻珠， 王麗娜， 張 力， 李 弘△

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086)

目的：探討小劑量多巴胺(DA)對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠心肌細胞凋亡的作用及可能機制。方法：采用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞，隨機分為正常對照組(control)，過氧化氫處理組(H2O2)，小劑量多巴胺干預(yù)組(DA+H2O2)，多巴胺受體Ⅰ型阻斷劑干預(yù)組(DR1+DA+H2O2)，多巴胺受體II型阻斷劑干預(yù)組(DR2+DA+H2O2)；應(yīng)用流式細胞儀、MTT檢測心肌細胞的凋亡率，透射電子顯微鏡檢測細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，比色法檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，Western blot檢測Cytochrone c、Caspase 3、Caspase 9的蛋白表達情況。結(jié)果：與單純H2O2組相比，小劑量多巴胺(10 μmol/L)可降低LDH活性，升高SOD活性，抑制心肌細胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的表達；DR1阻斷劑SCH-23390干預(yù)后，能夠部分逆轉(zhuǎn)這種作用，而DR2阻斷劑Haloperido干預(yù)后沒有明顯的變化。結(jié)論：小劑量多巴胺可能通過DR1抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

凋亡；多巴胺；心肌細胞；氧化應(yīng)激；大鼠

心力衰竭(heart failure，HF)是各種心血管疾病的終末階段，是工業(yè)化國家首位死亡原因，而心肌細胞凋亡是導(dǎo)致心衰的重要原因。心肌細胞凋亡的發(fā)生機制復(fù)雜，目前認為主要與氧化應(yīng)激、心臟負荷增加、炎癥反應(yīng)、缺血缺氧、神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)[1]。研究證實, 各種類型的心力衰竭患者和動物模型都存在氧自由基過量生成的現(xiàn)象，因此如何通過抑制氧化應(yīng)激，降低心肌細胞的凋亡率，從而改善心臟功能已成為目前心血管領(lǐng)域研究的熱點[2]。

多巴胺(dopamine, DA)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，屬于內(nèi)源性的兒茶酚胺。多巴胺在腦內(nèi)含量較高，外周相對較低，因此，對多巴胺的研究歷來主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究顯示，在低溫貯存的細胞和腎臟中加入多巴胺，能夠抑制氧化應(yīng)激，改善移植后的細胞和腎臟功能[3，4]。在大鼠血管平滑肌細胞，小劑量多巴胺作為抗氧化劑，抑制平滑肌細胞的增殖[5]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，采用原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞，利用過氧化氫處理作為氧化應(yīng)激的細胞模型，觀察小劑量多巴胺及其受體阻斷劑對心肌細胞凋亡的作用[6]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar乳鼠(1～3 d，雌雄不限)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液、優(yōu)等胎牛血清 (Hyclone)；DR1阻斷劑SCH-23390、DR2阻斷劑Haloperido、MTT(Sigma)；Western 及IP細胞裂解液(Beyotime)；Western Blue(Promega)；Anexin-V凋亡檢測試劑盒(北京寶賽)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)測定試劑盒(南京建成)；Fas、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9抗體(Santa Cruz)；其他試劑均為分析純。

1.3 主要器材

倒置相差顯微鏡(OLYMPUS IX70)，培養(yǎng)箱(SANYO)，VS-1300-U凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)，Western blot電泳槽(BIO-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)2000(美國BIO-RAD)，高速低溫離心機(美國Beckman)，US-640紫外分光光度計(Beckman)，酶標儀(美國Biotek)。

1.4 新生大鼠心肌細胞的培養(yǎng)

按文獻方法，取出生1～3 d的Wistar乳鼠心臟，經(jīng)0.25%胰蛋白酶分3次消化成單細胞懸液, 經(jīng)離心、洗滌后加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，差速貼壁法于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2 h。將富含心肌細胞的培養(yǎng)液再次接種于含10%胎牛血清、1 μmol/L阿糖胞苷的高糖DMEM中，24 h換液，去除阿糖胞苷后48 h加干預(yù)藥物。

1.5 實驗細胞分組

正常對照組(control)：正常培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，未做任何干預(yù)，培養(yǎng)時間同其他組； 過氧化氫處理組(H2O2)：取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，加入過氧化氫，終濃度為100 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；小劑量多巴胺干預(yù)組(DA+H2O2)：取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，加入多巴胺，終濃度為10 μmol/L，培養(yǎng)2 h后加入過氧化氫，終濃度為100 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；多巴胺受體D1阻斷劑干預(yù)組(DR1+DA+ H2O2)：取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，加入DR1阻斷劑，終濃度10 mmol/ L，培養(yǎng)2 h，其他同小劑量多巴胺干預(yù)組(DA+H2O2)；多巴胺受體D2阻斷劑干預(yù)組(DR2+DA+H2O2)同DR1。

羅璨璨(1994—)，女，福建仙游人，碩士研究生，研究方向為巖土工程數(shù)值模擬、大壩與基礎(chǔ)工程等方面的研究工作。

1.6 流式細胞儀檢測凋亡率

分別取各組培養(yǎng)的心肌細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×106cells/ml，制成單細胞懸液，加入100 μl Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V(20 μg/ml)10 μl，室溫避光30 min，再加入PI(50 μg/ml)5 μl，避光反應(yīng)5 min后，加入400 μl Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測。

1.7 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

0.25%胰蛋白酶消化細胞4 min，PBS洗滌1遍，2 000 r/min離心10 min，棄上清收集細胞；4℃，2.5%戊二醛固定；1%鋨酸固定，常規(guī)乙醇、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.8 MTT檢測細胞存活率

培養(yǎng)于96孔板中的細胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)后,每孔加入MTT溶液20 μl (5 mg/ml )，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。設(shè)置空白對照(只有DMSO，沒有細胞)，490 nm 波長酶標儀檢測各孔吸光度( A ) 值。設(shè)定正常對照組細胞存活率為100%，實驗組細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

(1)取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，分別加入不同濃度的過氧化氫0、10、20、50、100、150、200、300、500 μmol/L，培養(yǎng)72 h，利用MTT檢測細胞存活率。(2)取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，分別加入不同濃度的多巴胺0、1、10、20、50、100、500、1 000、10 000 μmol/L，培養(yǎng)72 h，利用MTT檢測細胞存活率。(3)取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，分別加入不同濃度的多巴胺0、100、100、100、100 μmol/L，培養(yǎng)2 h，再分別加入不同濃度的過氧化氫0、0、1、10、20 μmol/L，培養(yǎng)72 h，利用MTT檢測細胞存活率。(4)取培養(yǎng)48 h的乳鼠心肌細胞，分為對照組(只加入PBS)，單純過氧化氫組(100 μmol/L)，小劑量多巴胺干預(yù)組(10 μmol/L多巴胺預(yù)孵育2 h，再加入100 μmol/L過氧化氫)，多巴胺受體D1阻斷劑干預(yù)組(預(yù)先加入10 mmol/ L DR1阻斷劑培養(yǎng)2 h，再加入10 μmol/L多巴胺孵育2 h，最后加入100 μmol/L過氧化氫)，多巴胺受體D2阻斷劑干預(yù)組同多巴胺受體D1阻斷劑干預(yù)組。利用MTT檢測各組細胞存活率。

1.9 LDH和SOD活性檢測

取各組細胞的培養(yǎng)液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；按試劑盒說明書操作，運用紫外分光光度計記錄吸光度(OD)值，計算細胞乳酸脫氫酶LDH和SOD活性。

1.10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達

取各組培養(yǎng)的心肌細胞，PBS洗滌，加入全細胞裂解液，冰上處理10 min，4℃，12 000×g離心15 min，取上清進行蛋白質(zhì)定量。取50 μg總蛋白樣品于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用10%無脂肪牛奶封閉后，分別用1∶1 000抗 Cytochrone c 、Caspase 3、Caspase 9，4℃孵育過夜。再用二抗(堿性磷酸酶標記，稀釋度1∶1 000) 室溫孵育1 h，最后用Western blue stabilized substrate for AP (Promega)顯色，光密度掃描半定量分析顯影條帶。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細胞存活率變化

(1)隨著H2O2濃度增高，細胞存活率逐漸降低，50 μmol/L導(dǎo)致心肌細胞存活率降至(62.68±10.37)%，100 μmol/L為(46.4±9.08)%，200 μmol/L為(43.32±8.47)%。因此后續(xù)實驗采用100 μmol/L；(2)不同濃度的多巴胺刺激心肌細胞，當濃度超過100 μmol/L，細胞存活率有所降低；(3)與單純H2O2組相比，1 μmol/L多巴胺干預(yù)，細胞存活率沒有明顯的提高，10 μmol/L，20 μmol/L多巴胺干預(yù)，細胞存活率明顯的提高，因此后續(xù)實驗采用10 μmol/L；(4)使用多巴胺受體DR1的阻斷劑，能夠抑制多巴胺的這種保護作用；而使用多巴胺受體DR2的阻斷劑，細胞存活率沒有明顯變化(圖1)。

2.2 各組細胞凋亡率變化

流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。(1)過氧化氫處理組的凋亡率(49.27±0.03)%較正常對照組明顯增高(6.59±0.03)%(P<0.01)；(2)與過氧化氫處理組相比，小劑量多巴胺預(yù)處理后，凋亡率明顯降低 (18.07±0.02)%(P<0.01)；(3)DR1阻斷劑處理后取消了這種作用(32.48±0.02)%(P<0.01)；(4)DR2阻斷劑處理后沒有明顯的變化(21.47±0.03)%(圖2)。

Fig.. 2 Cell apoptosis rate in different groups (n=8) H2O2： Hydrogen peroxide； DR： Dopamine receptor antagonist; DA: Dopamine**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsH2O2group；△△P<0.01vsDA+ H2O2group

2.3 各組細胞超微結(jié)構(gòu)變化

正常對照組心肌細胞核染色質(zhì)疏松，密度均勻，線粒體結(jié)構(gòu)完好；過氧化氫處理組核膜皺縮、染色質(zhì)凝聚，線粒體腫脹破裂；小劑量多巴胺干預(yù)后，核膜結(jié)構(gòu)較完好，染色質(zhì)部分凝聚，細胞損傷較過氧化氫處理組輕；DR1阻斷劑處理后，細胞超微結(jié)構(gòu)變化與過氧化氫處理組相似，線粒體腫脹和空泡化，肌絲溶解；DR2阻斷劑處理后，細胞變化不明顯(圖3)。

2.4 各組細胞培LDH和SOD活性的變化

與正常對照組相比，過氧化氫處理后LDH活性明顯升高，SOD活性明顯降低；與過氧化氫處理相比，小劑量多巴胺處理后，降低了LDH活性，升高了SOD活性；DR1阻斷劑處理后，取消了上述作用，而DR2阻斷劑處理后，沒有明顯的改變(表1)。

Fig. 3 Morphologic changes with transmission electron microscope H2O2： Hydrogen peroxide； DR： Dopamine receptor antagonist

GroupLDH(U/ml)SOD(U/ml)Control35.55±4.1048.18±6.03H2O295.40±10.05**18.12±3.02**DA+H2O250.64±6.12##41.23±5.04##DR1+DA+H2O285.21±8.02△△22.09±3.01△△DR2+DA+H2O255.32±6.7839.09±4.01

H2O2： Hydrogen peroxide； DA: Dopaminee； DR： Dopamine receptor antagonist； LDH: Lactate dehydrogenase； SOD： Superoxide dismutase

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsH2O2group；△△P<0.01vsDA+H2O2group

2.5 各組細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

Western blot 結(jié)果顯示，與正常對照組相比，過氧化氫處理后Cytochrome c，Caspase 3，Caspase 9蛋白表達增加；與過氧化氫處理相比，小劑量多巴胺處理后，上述凋亡相關(guān)蛋白明顯降低；DR1阻斷劑處理后，蛋白表達變化同過氧化氫處理組類似，與單純多巴胺處理組相比，使用DR2阻斷劑處理后，凋亡相關(guān)蛋白沒有明顯的改變(圖4)。

3 討論

心肌細胞作為終末分化細胞，正常情況下不存在明顯的凋亡。但在疾病狀態(tài)下，例如心肌梗塞、心肌缺血、缺氧及再灌注損傷，心肌細胞出現(xiàn)明顯的凋亡；而活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)在細胞凋亡過程中起著舉足輕重的作用。ROS是外源性氧化劑或細胞內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的具有高生物活性含氧化合物的總稱，包括超氧化物、過氧化氫、單線態(tài)氧和氫氧根陰離子等[7]。本實驗利用過氧化氫處理培養(yǎng)的心肌細胞，復(fù)制氧化應(yīng)激的細胞模型。結(jié)果顯示，隨著過氧化氫濃度的增高，細胞存活率明顯降低，呈劑量依賴關(guān)系；同時凋亡相關(guān)蛋白表達也明顯增加，提示使用該模型研究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細胞凋亡是可行的。

Fig. 4 Expression of apoptosis protein in cardiomyocyte of different groups H2O2： Hydrogen peroxide； DA： Dopamine； DR： Dopamine receptor antagonist**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsH2O2group；△P<0.05，△△P<0.01vsDA+H2O2group

生理狀態(tài)下，多巴胺調(diào)節(jié)軀體運動和精神活動。在某些病理狀態(tài)下，例如腦缺血性疾病，多巴胺急劇增加(超過50 mmol/L)，會產(chǎn)生毒性而引起細胞凋亡[8]。但研究表明，小劑量的多巴胺則具有抗氧化作用。本實驗研究結(jié)果顯示，當多巴胺濃度超過100 μmol/L , 可降低細胞存活率，而小劑量多巴胺(10 μmol/L)對細胞存活率沒有明顯的影響。另外使用小劑量多巴胺預(yù)處理，使細胞對后來高濃度的過氧化氫刺激作用有了抵抗，引起凋亡率降低，這種保護作用可以看做是一種預(yù)適應(yīng)[9]。因為多巴胺在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物是自由基類物質(zhì)，預(yù)先使用小劑量的自由基，刺激機體產(chǎn)生抗氧化酶類，從而能夠抵抗接下來的大劑量自由基對細胞的損傷作用。

無論在中樞，還是在外周，多巴胺執(zhí)行各種功能，發(fā)揮其重要的作用，都需要與相應(yīng)受體結(jié)合才能完成。研究顯示，大劑量多巴胺主要與腎上腺素能受體結(jié)合，而小劑量多巴胺則與多巴胺受體結(jié)合。多巴胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，根據(jù)生化和藥理學(xué)特性的不同，將其分為D1樣和D2樣受體，其中D1主要位于突觸后，受體與腺苷酸環(huán)化酶正性耦聯(lián)，與G蛋白中刺激亞單位(Gs)結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使cAMP增高，刺激磷脂酶C，從而激活鈣通道，使細胞內(nèi)鈣增高。D2樣受體位于突觸前和突觸后，與腺苷酸環(huán)化酶負性耦聯(lián)，與 Gi/Gq作用，抑制AC，使cAMP降低，抑制鈣通道，調(diào)節(jié)鉀通道[10，11]。研究顯示，在血管平滑肌細胞中，多巴胺發(fā)揮抗氧化作用主要通過DR1[5]。本實驗使用DR1阻斷劑，發(fā)現(xiàn)的確可以逆轉(zhuǎn)小劑量多巴胺的保護作用，因此證實在心肌細胞中，多巴胺也是通過DR1發(fā)揮抗氧化作用。在心肌細胞，ROS的主要來源是線粒體，因此本實驗主要觀察了細胞色素C的表達情況，結(jié)果顯示小劑量多巴胺可以抑制線粒體釋放細胞色素C，從而降低凋亡率。

綜上所述，小劑量多巴胺對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細胞的保護作用，主要是通過DR1介導(dǎo)的抑制線粒體途徑凋亡的發(fā)生。

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Effects and mechanisms of low concentration dopamine on hydrogen peroxide-induced apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes

CAI Xiao-na, SHI Sa, LI Hong-zhu, WANG Li-na, ZHANG Li, LI Hong△

(Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)

Objective: To study the effects of low concentration dopamine(DA) on hydrogen peroxide-induced apoptosis in cultured rat cardiomyocytes as well as the possible molecular mechanisms. Methods: Cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into the following groups: control group(control), hydrogen peroxide group(H2O2), pretreated with low concentration dopamine(DA+ H2O2), dopamine receptor 1(DR1) antagonist group (DR1+DA+H2O2), dopamine receptor 2(DR2) antagonist group (DR2+DA+H2O2). The cell apoptosis was then assessed by MTT and flow cytometry. The cellular ultrastructure changes were observed by transmission electron microscope. The activity of lactate dehydrogenase( LDH )and superoxide dismutase (SOD) in cell medium was analyzed by colorimetry. The protein expressions of Cytochrone c, Caspase 3 and Caspase 9 were obtained by Western blot. Results: Compared with hydrogen peroxide group, low concentration dopamine(10 μmol/L)decreased the apoptosis rate and the expression of protein of apoptosis related protein, enhanced SOD activity, decreased LDH activity. DR1 antagonist SCH-23390 treatment inhibited dopamine induced cardiac protective effect. DR2 antagonist haloperido treatment had no changes compared with dopamine group. Conclusion: Above findings indicate that low concentration dopamine inhibits apoptosis induced by hydrogen peroxide in neonatal rat cardiomyocytes, which is partly associated with the activation of DR1.

apoptosis; dopamine; cardiomyocyte; hydrogen peroxide; rats

黑龍江省自然科學(xué)基金項目資助(D200880)；黑龍江省教育廳課題(12521181)

2014-09-01 【修回日期】2014-11-03

R363.2

A

1000-6834(2015)01-067-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.020

△【通訊作者】Tel: 0451-86699587； E-mail: drlihong1971@163.com