磺化石墨烯對小麥幼苗生長及生理生化指標(biāo)的影響

常海偉，任文杰，劉鴻雁，滕應(yīng),*，李麗娜

1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025 2.中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所) ，南京 210008

磺化石墨烯對小麥幼苗生長及生理生化指標(biāo)的影響

常海偉1,2，任文杰2，劉鴻雁1，滕應(yīng)2,*，李麗娜2

1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025 2.中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所) ，南京 210008

隨著石墨烯生產(chǎn)量和使用量的不斷增大，其對生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)逐漸引起了環(huán)境學(xué)家的關(guān)注。采用水培試驗(yàn)，探究了磺化石墨烯(SGO)對小麥幼苗的生長、抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化的影響。結(jié)果表明：在培養(yǎng)10 d后，低濃度磺化石墨烯對小麥根系的生長有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)，200 mg·L-1濃度處理與對照處理相比提高了84.3%，隨著濃度增加促進(jìn)作用逐漸減弱，1 000 mg·L-1時(shí)與對照相比提高了19.9%。但對小麥地上部的生長沒有影響?；腔┨幚淼男←溣酌绺岛腿~片組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)及丙二醛(MDA)都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當(dāng)磺化石墨烯濃度低于200 mg·L-1時(shí)，處理組小麥抗氧化酶的活性及MDA含量相對于對照處理大都有所降低，說明低濃度時(shí)磺化石墨烯沒有對小麥的生長產(chǎn)生氧化脅迫，這與磺化石墨烯可能具有一定的抗氧化能力有關(guān)，而高濃度時(shí)由于產(chǎn)生氧化脅迫使各項(xiàng)生理生化指標(biāo)逐漸上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為石墨烯材料對植物的毒理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

磺化石墨烯；小麥；抗氧化酶；MDA

石墨烯(graphene)是由碳原子sp2雜化形成的具有二維結(jié)構(gòu)的新型納米材料[1]。由于具有很高的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)異的導(dǎo)電性能、 獨(dú)特的光學(xué)特征和良好的電化學(xué)特性，故石墨烯可以廣泛應(yīng)用于電子、光學(xué)、醫(yī)療器械、化妝品、食品包裝、水處理等各個(gè)行業(yè)[2-4]。近年來，納米產(chǎn)品正以每3年翻一番的速度增長，預(yù)計(jì)到2020年將達(dá)到3萬億的市場價(jià)值[5]，而石墨烯作為納米材料中的佼佼者必將占據(jù)重要地位。隨著石墨烯生產(chǎn)量和使用量的不斷增大，不可避免地會進(jìn)入到大氣、水體和土壤等環(huán)境中，因此石墨烯對生態(tài)環(huán)境和人類健康的影響逐漸引起了環(huán)境學(xué)家的關(guān)注。

目前關(guān)于石墨烯對生態(tài)環(huán)境的效應(yīng)研究主要集中在動(dòng)物[6-7]和細(xì)菌活性[8-9]方面。已有報(bào)道指出，石墨烯由于具有強(qiáng)吸附能力和高化學(xué)活性，容易與有機(jī)體相互作用并引起組織損傷甚至細(xì)胞凋亡[10]。植物是生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的重要組成部分和主要的初級生產(chǎn)者，因此研究石墨烯對植物的毒性以及環(huán)境效應(yīng)至關(guān)重要。已有一些學(xué)者對石墨烯等納米材料對植物的發(fā)芽率[11]、根長、株高和代謝[12]的影響展開了研究。研究結(jié)果表明不同濃度石墨烯、氧化石墨烯都能引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體受損死亡[13]。但是隨著納米材料的種類、暴露時(shí)間、劑量，還有植物種類的不同，影響程度也會有所不同[14]?；腔?SGO)是否同其他納米材料一樣具有相同的影響，目前還不得而知。本研究以小麥作為供試植物，分析了在不同濃度SGO脅迫下，小麥幼苗生長、抗氧化酶活性及丙二醛含量等指標(biāo)的變化情況，了解SGO對小麥幼苗的毒性效應(yīng)，從而為石墨烯的毒性評價(jià)、生態(tài)環(huán)境效應(yīng)等提供科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與儀器

SGO由蘇州高通新材料有限公司提供，其掃描電鏡圖像如圖1。從掃描電鏡圖像可見，其結(jié)構(gòu)非常規(guī)整。

小麥種子購于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)神州種業(yè)公司，品種為南農(nóng)9918。測定小麥幼苗生理生化指標(biāo)的相關(guān)試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)品購于南京建成生物工程研究所。NaCl、冰醋酸為分析純，乙醇、NaOH和HNO3為優(yōu)級純，均購于南京博巧生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

圖1 磺化石墨烯(SGO)的掃描電鏡圖像

實(shí)驗(yàn)儀器：752紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，人工氣候恒溫培養(yǎng)室，Allegra X-型高速離心機(jī)(貝克曼庫爾特公司，美國)，KQ-300VDE型超聲波儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

選取顆粒飽滿、大小均勻的小麥種子，經(jīng)3%的H2O2水溶液表面消毒10 min后，用去離子水充分沖洗。在(25±1) ℃的培養(yǎng)箱中催芽48 h。配制不同濃度(0、50、100、200、500、800、1 000 mg·L-1)的SGO分散液，分別取50 mL分散液于培養(yǎng)瓶中，采用0.1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.3～6.5之間，然后將定植籃放置于培養(yǎng)瓶中，此時(shí)培養(yǎng)瓶中的SGO分散液剛好將定植籃浸沒，挑選芽長一致的種子均勻擺放于定植籃上。將培養(yǎng)瓶放置于智能光照培養(yǎng)室(光照強(qiáng)度60% Lx，25 ℃，光照10 h，黑暗14 h)中進(jìn)行培養(yǎng)。以不加SGO的處理作為對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。每天補(bǔ)水至初始液面處，震蕩使得溶液混合均勻，培養(yǎng)10 d。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量及根長、株高的測定

培養(yǎng)結(jié)束后，用去離子水沖洗干凈，用吸水紙吸干植株表面水分。測定株高和根長，稱量鮮重，然后將根和葉分開，分別稱量根部和地上部鮮重，根據(jù)以下公式計(jì)算根冠比：根冠比=根部鮮重(g)/地上部鮮重(g)。

1.3.2 小麥抗氧化酶活性及丙二醛含量的測定

將一定量的植物地上部和根部分別置于液氮中速凍，各加入體積為9倍于鮮重的生理鹽水，在冰浴中研磨，冰水浴提取20 min后，將得到的10%組織勻漿液于4 000 r·min-1(4°C)離心20 min，上清液即可用于各指標(biāo)的分析測定。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)等生理生化指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS19.0軟件，以單因素方差分析(One way ANOVA)對SOD、POD、CAT等酶的活性和MDA含量變化進(jìn)行差異性分析，并采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 SGO對小麥幼苗生長的影響

如圖2所示，培養(yǎng)10 d后，不同濃度SGO處理下，小麥幼苗的根長均顯著(P<0.05)高于對照處理。當(dāng)SGO濃度為50～200 mg·L-1時(shí)，各濃度處理之間小麥幼苗的根長沒有顯著差異，200 mg·L-1處理時(shí)，小麥幼苗根長最長，相比于對照提高84.3%；而當(dāng)SGO濃度為200～1 000 mg·L-1時(shí)，小麥幼苗的根長隨著SGO濃度的增加而降低，1 000 mg·L-1處理時(shí)，小麥幼苗的根長相比對照提高了19.9%。結(jié)果表明SGO在試驗(yàn)濃度范圍能促進(jìn)小麥根的伸長，但濃度相對較高時(shí)，這種促進(jìn)作用會逐漸降低。然而各濃度處理的小麥幼苗地上部長度與對照相比無顯著差異。

根冠比(root/shoot ratio)是指植物地下部分與地上部分的鮮重或干重的比值。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，往往力求促進(jìn)根系生長，增大根冠比，為作物幼苗期創(chuàng)造良好的營養(yǎng)條件。若根系生長受到促進(jìn)(或阻礙)，根冠比往往會表現(xiàn)出升高(或下降)的趨勢。如圖2所示，在各濃度SGO處理下，小麥幼苗的根冠比與對照相比顯著增大，隨著SGO濃度的增加根冠比隨之增加，到200 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，后又隨濃度的增加逐漸下降，這與小麥根長先增加后降低的趨勢保持一致。

圖2 SGO對小麥根長、株高及根冠比的影響

2.2 SGO對小麥幼苗SOD活性的影響

2.3 SGO對小麥幼苗POD和CAT活性的影響

POD和CAT的反應(yīng)底物都是H2O2，能夠清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，在抑制植物膜脂過氧化方面發(fā)揮著重要作用。它們的誘導(dǎo)說明植物體內(nèi)產(chǎn)生了大量的H2O2，使植物體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。從圖4可以看出，各濃度處理幼苗的根系POD活性顯著低于對照，SGO濃度為200 mg·L-1時(shí)降到最低(相對于對照降低了26.5%)。葉片中200 mg·L-1濃度處理的POD活性比對照顯著降低了18.1%，其余處理與對照相比均無顯著差異，根中CAT活性除50 mg·L-1濃度較對照處理顯著提高24.5%，其余各濃度處理均無明顯差異，而葉中CAT活性相對于對照先降低后又逐漸升高。就總體趨勢來看，2種酶活性在低濃度時(shí)降低(200 mg·L-1最低)后隨濃度增大而升高。

圖3 SGO對小麥根系和葉片中SOD活性的影響

2.4 SGO對小麥幼苗MDA含量的影響

當(dāng)植物受到比較嚴(yán)重的脅迫時(shí)，大量活性氧(ROS)會超過抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，活性氧自由基就會在植物體內(nèi)積累導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷。而MDA是膜質(zhì)過氧化作用的重要產(chǎn)物之一，它的含量可表示膜質(zhì)過氧化作用的損傷程度。如圖5所示，低濃度(小于200 mg·L-1)時(shí)，根和葉中MDA含量逐漸降低，隨著濃度的升高(大于200 mg·L-1)，MDA含量又逐漸升高，但是與對照相比，各濃度處理均顯著降低。

3 討論(Discussion)

已有研究表明大部分納米材料對植物生長具有毒害作用，而本研究結(jié)果與之相反。在所試濃度范圍內(nèi)，SGO能夠明顯促進(jìn)小麥根系生長，增大根冠比，當(dāng)濃度大于200 mg·L-1時(shí)，隨濃度增大促進(jìn)作用逐漸減弱，而地上部分與對照處理相比沒有顯著差異(圖1)。這可能是由于SGO只是吸附到根系表面，因?yàn)橹参锏募?xì)胞壁和凱氏帶對SGO進(jìn)入細(xì)胞起阻礙作用。根系表面吸附的SGO可能會刺激根細(xì)胞的水通道蛋白，促進(jìn)細(xì)胞吸水，提高細(xì)胞的含水量進(jìn)而促進(jìn)根細(xì)胞的各種代謝[15-16]。在幼苗凱氏帶尚未形成時(shí)，可能有少量SGO通過細(xì)胞壁孔隙進(jìn)入根細(xì)胞并經(jīng)導(dǎo)管轉(zhuǎn)移到地上部[17]，但不足以對葉片生長產(chǎn)生影響，SGO進(jìn)入細(xì)胞時(shí)由于機(jī)械力破壞了細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞持水量增加[18]，因而也能促進(jìn)根系細(xì)胞的伸長。Wang等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)氧化多壁碳納米管(o-MWCNTs)能夠顯著促進(jìn)根區(qū)細(xì)胞的伸長并增加脫氫酶的活性進(jìn)而促進(jìn)小麥根系的快速生長。

圖4 SGO對小麥根系和葉片中POD和CAT活性的影響

圖5 SGO對小麥根系和葉片中MDA含量的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SGO脅迫對小麥的生長及酶活性產(chǎn)生了一定的影響，但對于不同濃度SGO對植物產(chǎn)生不同效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)理還不是很清楚，這將是今后研究的重點(diǎn)。

致謝：感謝蘇州高通新材料有限公司為本研究免費(fèi)提供磺化石墨烯。

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◆

Effect of Sulfonated Graphene on Seedling Growth and Physiological and Biochemical Indices of Wheat

Chang Haiwei1,2,Ren Wenjie2,Liu Hongyan1,Teng Ying2,*,Li Lina2

1.College of Resource and Environmental Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China 2.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008,China

26 January 2015 accepted 13 May 2015

With the increasing consumption and production amount of graphene,its risk to ecological environment attracts growing concern of environmentalists.The effect of sulfonated graphene (SGO) on seedling growth,antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation content of wheat was investigated based on hydroponic experiments.The results showed that sulfonated graphene at low concentrations significantly promoted wheat root length (P<0.05) after culturing for 10 d.Compared to the control treatment,the root length was increased by 84.3% at a concentration of 200 mg·L-1.However,the promotion effect gradually decreased as the concentration increased,and the root length was increased by 19.9% at a concentration of 1 000 mg·L-1.No obvious effect was observed on wheat shoot length.The activities of superoxide-dismutase (SOD),catalase (CAT),peroxidase (POD) and the content of malondialdehyde (MDA) in roots and leaves were decreased at first and then increased after 10 d.These indices at graphene concentrations below 200 mg·L-1were higher than those of the control treatment,indicating that sulfonated graphene did not generate oxidative stress at low concentrations,which may be due to the antioxidant capacity of sulfonated graphene.Sulfonated graphene generated oxidative stress at high concentrations,resulting in the increasing physiological and biochemical indices.These results have provided basic data for plant toxicology of graphene.

sulfonated graphene; wheat; antioxidant enzymes; MDA

國家自然科學(xué)基金青年基金(No.41401565)

常海偉，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境化學(xué)，E-mail: chw1207818533@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yteng@issas.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150126002

2015-01-26 錄用日期：2015-05-13

1673-5897(2015)4-123-06

X171.5

A

滕應(yīng)(1975- )，男，土壤學(xué)博士，研究員，主要從事污染土壤環(huán)境過程與生物修復(fù)、污染土壤微生物生態(tài)與風(fēng)險(xiǎn)評估、土壤污染化學(xué)生物學(xué)等方面研究。

常海偉，任文杰，劉鴻雁,等.磺化石墨烯對小麥幼苗生長及生理生化指標(biāo)的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015,10(4): 123-128

Chang H W,Ren W J,Liu H Y,et al.Effect of sulfonated graphene on seedling growth and physiological and biochemical indices of wheat [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 123-128 (in Chinese)