微宇宙技術(shù)和物種敏感度分布曲線法評(píng)估銅離子生態(tài)危害比對(duì)研究

劉建梅，王蕾，劉濟(jì)寧，石利利,#，陳英文，沈樹寶

1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009 2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

微宇宙技術(shù)和物種敏感度分布曲線法評(píng)估銅離子生態(tài)危害比對(duì)研究

劉建梅1,2，王蕾2，劉濟(jì)寧2，石利利2,#，陳英文1,*，沈樹寶1

1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009 2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

為對(duì)比微宇宙方法和物種敏感度分布曲線法在銅離子生態(tài)危害評(píng)估中的差異，構(gòu)建了包括浮游藻類、輪蟲和大型溞的微宇宙系統(tǒng)，持續(xù)監(jiān)測了銅離子濃度、物種豐度和系統(tǒng)理化性質(zhì)的變化，推導(dǎo)出銅離子對(duì)微宇宙系統(tǒng)的63 d無顯著效應(yīng)濃度(63 d-NOEC)；同時(shí)，將銅離子對(duì)魚類、甲殼類、昆蟲類、藻類及軟體動(dòng)物等對(duì)銅離子的長期毒性數(shù)據(jù)通過物種敏感度分布曲線法進(jìn)行擬合，推導(dǎo)出對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中95%物種無顯著危害的作用濃度(HC5)。測試結(jié)果表明，大型溞種群在銅離子110.80 μg·L-1作用下暫時(shí)消失，導(dǎo)致了系統(tǒng)中輪蟲和藻類數(shù)量的增長，試驗(yàn)后期銅離子濃度降低，大型溞種群呈現(xiàn)恢復(fù)的趨勢；在212.06及420.26 μg·L-1銅離子作用下，藻類和輪蟲的存活受到嚴(yán)重抑制，在試驗(yàn)后期也沒有恢復(fù)。與物種敏感度分布曲線法推導(dǎo)得出的HC5值相比，通過微宇宙系統(tǒng)得出的NOEC值較高，這可能是微宇宙系統(tǒng)中銅離子生物可利用性在各相介質(zhì)間的差異及種間反饋調(diào)節(jié)造成的。

銅離子；微宇宙；物種敏感度分布曲線；生態(tài)危害

生態(tài)危害評(píng)估、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)表征是化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一般步驟。其中，生態(tài)危害評(píng)估是定性和(或)定量評(píng)估生物體、系統(tǒng)或(亞)種群暴露于化學(xué)物質(zhì)中的潛在危害性，是化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的首要任務(wù)[1]。傳統(tǒng)的生態(tài)危害評(píng)估是基于化學(xué)品對(duì)某一種或幾種敏感生物進(jìn)行單一物種的毒性測試數(shù)據(jù)，運(yùn)用評(píng)估因子法(assessment factor,AF)、物種敏感度分布曲線法(species sensitivity distribution,SSD)[2-3]等外推方法來計(jì)算外源污染物的預(yù)測無效應(yīng)濃度(predicted no effect concentration,PNEC)[4]。然而隨著生態(tài)毒理學(xué)的發(fā)展，20世紀(jì)70年代的毒理學(xué)家認(rèn)識(shí)到基于單一物種毒性數(shù)據(jù)的危害評(píng)估不能較好地反映真實(shí)生態(tài)系統(tǒng)的種內(nèi)、種間關(guān)系和反饋機(jī)制，其評(píng)估結(jié)果和實(shí)際效果可能存在較大偏差[5]。由此生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的“微宇宙”技術(shù)被引入到生態(tài)危害評(píng)估中，即利用人工構(gòu)建的生態(tài)系統(tǒng)開展測試進(jìn)而評(píng)估化學(xué)品的環(huán)境歸趨和生物危害[6-7]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，國外在利用水生微宇宙進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，美國化學(xué)品安全與污染防治辦公室(OCSPP)[8]、美國試驗(yàn)與材料協(xié)會(huì)(ASTM)[9]、經(jīng)合組織(OECD)[10]均已出臺(tái)相關(guān)導(dǎo)則指導(dǎo)并規(guī)范水生微宇宙測試。此外，荷蘭瓦格寧根大學(xué)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所Sinderhoeve研究中心自20世紀(jì)80年代即開展了一系列微宇宙和中宇宙的構(gòu)建及農(nóng)藥毒性暴露規(guī)律的研究，發(fā)展了一套較為系統(tǒng)的測試方法[11]，并據(jù)此建立了關(guān)于水生微宇宙測試的GLP實(shí)驗(yàn)室。目前國外的水生微宇宙研究已經(jīng)涉及農(nóng)藥、抗生素、工業(yè)化學(xué)品、重金屬等多類化學(xué)物質(zhì)以及混合物、實(shí)際污染源。而我國由于化學(xué)品環(huán)境管理起步較晚，目前的危害評(píng)估仍限于單一物種的毒性評(píng)估，水生微宇宙在化學(xué)品生態(tài)危害評(píng)估中的應(yīng)用很少，現(xiàn)有的、為數(shù)不多的研究所構(gòu)建的水生微宇宙系統(tǒng)生物效應(yīng)、功能效應(yīng)測試終點(diǎn)缺少系統(tǒng)、深入分析，測試結(jié)果不能全面反映化學(xué)品暴露作用引起的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的變化[12-16]。

隨著工業(yè)化的發(fā)展，以銅離子為代表的重金屬通過采礦、污水灌溉與排放等方式進(jìn)入水環(huán)境，通過直接致毒和食物鏈濃縮積累的方式危害水生態(tài)安全[17]。同時(shí)，由于銅離子對(duì)藻類及水生動(dòng)物的生存均產(chǎn)生不同程度的脅迫，國外相關(guān)研究普遍以其作為水生微宇宙測試的陽性對(duì)照物[18]。為了評(píng)估銅離子對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的危害、提供微宇宙試驗(yàn)有效性驗(yàn)證數(shù)據(jù)，本文在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化微宇宙的基礎(chǔ)上測定了其在銅離子長期暴露下物種豐度和理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，從系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能兩方面綜合評(píng)估銅離子的生態(tài)危害；同時(shí)與基于單一物種毒性數(shù)據(jù)的物種敏感度分布曲線法得到的危害評(píng)估結(jié)果對(duì)比，探討微宇宙技術(shù)和物種敏感度分布曲線法在生態(tài)危害評(píng)估中的差異，旨在為化學(xué)品生態(tài)危害方法的選擇提供借鑒。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS(Thermal Scientific Xseries，美國)，多功能水質(zhì)參數(shù)測定儀(HQ40d，美國哈希公司)，振蕩培養(yǎng)箱(INNOVA 43R，NBS公司)，顯微鏡(DM2500，德國Leica)，分光光度計(jì)(DR2800，美國哈希公司)，照度計(jì)(ZDS-10，上海嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠)，離心機(jī)(2-16PK，Sigma公司)，真空泵(AP-01P，天津奧特賽恩斯儀器公司)，超凈工作臺(tái)(SW-OJ-IFD，蘇州安泰空氣技術(shù)公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3750，日本三洋公司)，超聲清洗器(南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備公司)，溫濕度計(jì)(SQ6HM10，武漢中西儀器公司)。

配制Taub培養(yǎng)基[7]和魯哥氏液。五水硫酸銅(分析純，成都科龍化工試劑廠)，超純水(電阻率 = 18.2 MΩ.cm)，丙酮(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 供試生物

小球藻(Chlorella vulgaris)、羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)、四尾柵藻(Scendesmus quadricauda)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)均購自武漢水生所淡水藻種庫，采用T82MV培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(21～24) ℃ (±2 ℃)，照度為3 000 lux(15%)，振蕩培養(yǎng)箱振蕩速度為100(±10) 次·min-1，每周轉(zhuǎn)接1次。

試驗(yàn)所用大型溞(Daphnia magna)由本實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)，馴養(yǎng)條件為(20～21) ℃，自然光照，采用Elendt M4作為馴養(yǎng)和試驗(yàn)介質(zhì)，試驗(yàn)開始前2周使用Taub培養(yǎng)基之T86MVK大型溞培養(yǎng)基馴養(yǎng)用于試驗(yàn)。以柵藻(Scenedesums subspicatus)濃縮液喂食，喂食量(以碳計(jì))為0.1～0.2 mg·(溞-1·d-1)。

萼花臂尾輪蟲來自南京師范大學(xué)，輪蟲培養(yǎng)液采用US EPA配方(去離子水配制，含NaHCO396 mg·L-1，CaSO4·2H2O 60 mg·L-1，MgSO460 mg·L-1，KCl 4 mg·L-1，pH 7.5左右)。每天投喂蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。輪蟲的培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度約4 000 lux，晝長比L:D=16 h:8 h，溫度(25±1) ℃。培養(yǎng)期間，每天更換1次培養(yǎng)液并檢查輪蟲產(chǎn)卵狀況。

1.3 毒性數(shù)據(jù)收集篩選與物種敏感度排序

用于推導(dǎo)HC5值的生物毒性數(shù)據(jù)均來自美國ECOTOX毒性數(shù)據(jù)庫[19]和OECD eChemPortal—全球化學(xué)物質(zhì)有害信息在線查詢通道[20]。毒理數(shù)據(jù)的篩選和處理遵循精確性、適當(dāng)性和可靠性的3個(gè)原則，對(duì)某測試終點(diǎn)有多個(gè)測試數(shù)據(jù)時(shí)，選擇對(duì)效應(yīng)和終點(diǎn)描述最精確和恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)；當(dāng)有多個(gè)可靠毒理數(shù)據(jù)可用時(shí)，選用幾何平均值，對(duì)于暴露時(shí)間不確定的數(shù)據(jù)均予以剔除。表1為搜集的包括銅離子對(duì)魚類、藻類、甲殼類、昆蟲類、軟體動(dòng)物等的長期毒性數(shù)據(jù)。

表1 推導(dǎo)銅離子HC5的慢性毒性數(shù)據(jù)Table 1 Chronic toxicity data used to extrapolate HC5 of copper ions

物種敏感度分布曲線法假設(shè)不同門類的生物由于生活史、生理構(gòu)造、行為特征和地理分布等不同而對(duì)污染物的毒性效應(yīng)響應(yīng)符合一定概率函數(shù)[21]。該法將篩選出的種平均毒性數(shù)據(jù)由小到大排列并設(shè)定相應(yīng)的序數(shù)R，根據(jù)序數(shù)計(jì)算出累計(jì)概率P(P=R/(N+1)，N為種平均毒性數(shù)據(jù)總數(shù))。然后將累計(jì)概率P和種平均毒性數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)值擬合出累計(jì)概率分布函數(shù)，即物種敏感度分布曲線。其中的擬合模型可選用Sigmoid，Weibull，Gompertz，Hill等多種SigmaPlot 12.0軟件內(nèi)置的函數(shù)，擬合優(yōu)度采用決定系數(shù)R2和圖像綜合判別。確定最佳擬合模型后推算出累計(jì)概率為5%的毒性值，即保護(hù)95%以上的物種不受污染物影響的HC5值。

1.4 微宇宙試驗(yàn)方法[9]

本研究設(shè)計(jì)的微宇宙包括藻、輪蟲、大型溞3個(gè)營養(yǎng)級(jí)生物組分，三者從低到高形成捕食關(guān)系。其中大型溞除捕食輪蟲外，還可直接捕食藻類。

微宇宙的構(gòu)建和馴化：準(zhǔn)備30個(gè)5 L的燒杯，每個(gè)燒杯中裝入200 g石英砂、0.5 g纖維素、0.5 g幾丁質(zhì)和3 L T82MV培養(yǎng)基以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化微宇宙系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室溫度維持在(20～22) ℃，光照約為3 000 lux，光周期為12 h(明)：12 h(暗)。第0天接種入4種藻類，使其初始細(xì)胞濃度為104cells·mL-1，第4天加入大型溞(16只·微宇宙-1)和萼花臂尾輪蟲(0.03只·mL-1)。第7天根據(jù)溶解氧變化、pH值、大型溞數(shù)量、羊角月牙藻數(shù)量以及微宇宙早期占優(yōu)勢藻種等指標(biāo)剔除差異較大的6個(gè)微宇宙。

微宇宙危害測試：在剩余的系統(tǒng)中加入受試物，并隨機(jī)分配不同處理組的位置。設(shè)置3個(gè)濃度：500、1 000和2 000 μg·L-1(以銅離子計(jì))，并設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)濃度6個(gè)平行。試驗(yàn)周期為63 d，pH、溶解氧濃度(DO)、葉綠素a含量和物種豐度等每周測定2次。

溶氧值分別在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定：早上光周期開始前(DO1)、下午光周期結(jié)束前(DO2)以及第2天的光周期開始前(DO3)。光合作用產(chǎn)氧量P=DO2-DO1，呼吸作用耗氧量R=DO2-DO3。pH值在取樣測定物種豐度當(dāng)天的光周期開始前進(jìn)行測定。

葉綠素a和物種豐度在同1天取樣測定。葉綠素取樣和測定方法參考標(biāo)準(zhǔn)SL88-2012“水質(zhì)葉綠素的測定-分光光度法”[22]。在水體較清澈且大型溞數(shù)量較少的情況下可以對(duì)大型溞進(jìn)行肉眼計(jì)數(shù)，在數(shù)量較多時(shí)，用取樣圓筒取一定體積的水樣再計(jì)數(shù)，最后進(jìn)行換算，單位為個(gè)·(100 mL)-1。取1～2 mL攪拌均勻的微宇宙水樣并用魯哥氏液固定，在倒置顯微鏡下用1 mL的浮游生物計(jì)數(shù)板對(duì)輪蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)(只·mL-1)。藻類的計(jì)數(shù)同樣將水樣用魯哥氏液固定，再采用視野計(jì)數(shù)法用0.1 mL的計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)(104或103cells·mL-1)。每周最后1次取水樣后向每個(gè)燒杯中加輪蟲培養(yǎng)液1滴(約0.05 mL)、4種藻的混合液(每種藻的接種濃度為104cells·mL-1)1 mL以補(bǔ)充取樣的損失，并加入大型溞使其數(shù)量為每燒杯至少3只。試驗(yàn)期間不再加入培養(yǎng)基。由于本試驗(yàn)早期固著藻類的采樣和鏡檢結(jié)果證實(shí)難以獲取組間可比的鑒定結(jié)果，所以放棄該指標(biāo)的顯微鏡計(jì)數(shù)，其數(shù)量沒有體現(xiàn)在總藻豐度中，故總藻豐度為小球藻、羊角月牙藻、斜生柵藻和四尾柵藻豐度的總和。但是葉綠素a的濃度同時(shí)涵蓋固著藻類和其他藻類。

本測試以小球藻、四尾柵藻、斜生柵藻、羊角月牙藻、大型溞和輪蟲等物種豐度及葉綠素a作為微宇宙系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化指標(biāo)，以pH、光合作用產(chǎn)氧量P、呼吸作用耗氧量R及P/R等理化指標(biāo)作為微宇宙系統(tǒng)功能變化指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

銅離子加權(quán)平均濃度的計(jì)算方法參考“化學(xué)品測試方法-生物系統(tǒng)效應(yīng)”大型溞繁殖試驗(yàn)的附錄5[23]。采用鄧恩特檢驗(yàn)(Dunnett’s tests，ANOVA，SPSS 17.0)多元對(duì)比分析微宇宙受試組和對(duì)照組的差異，分別確定引起微宇宙系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能變化的最低顯著效應(yīng)濃度(LOEC)(P<0.05)，無顯著效應(yīng)濃度(NOEC)即小于LOEC的前一個(gè)設(shè)定濃度。每個(gè)取樣日期最敏感毒性終點(diǎn)的NOEC即作為系統(tǒng)水平的NOEC[24]。

1.6 化學(xué)分析

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS測定水體中銅離子的濃度。儀器工作條件為：功率1 300 W，樣品氣(Ar)流量1.02 L·min-1，輔助氣(Ar)0.7 L·min-1，冷卻氣(Ar)14 L·min-1，蠕動(dòng)泵速20 r·min-1，1次讀數(shù)時(shí)間5 s，讀數(shù)次數(shù)3次，1次讀數(shù)樣品量0.01 mL。

2 結(jié)果(Results)

2.1 微宇宙系統(tǒng)毒性測試結(jié)果

2.1.1 銅離子濃度變化

圖1展示了在為期63 d的試驗(yàn)中各受試組水中銅離子的實(shí)測濃度。由實(shí)測濃度計(jì)算得到添加濃度為500，1 000和2 000 μg·L-1的微宇宙系統(tǒng)中銅離子的加權(quán)平均濃度分別為110.80，212.06和420.26 μg·L-1。由圖中可以看到，銅離子加入后水中實(shí)測濃度快速下降，到35 d時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定。水中銅離子濃度的快速下降一方面可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的H+、OH-或EDTA與銅離子結(jié)合而沉淀，另一方面可能是因?yàn)樗w中藻細(xì)胞、生物質(zhì)及沉積物對(duì)銅離子的吸附和富集[25]。

圖1 微宇宙中銅離子實(shí)測濃度變化趨勢

2.1.2 物種豐度

(1)大型溞豐度變化

試驗(yàn)期間各受試組大型溞的豐度(平均組計(jì)數(shù)的算術(shù)平均值，下同)變化見圖2(a)。由圖可見，大型溞的繁殖受銅離子抑制非常明顯，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)處理組的大型溞豐度遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組。在空白對(duì)照組中，試驗(yàn)初始大型溞的數(shù)量因?yàn)槭澄锍渥愣蠓鲩L，在第21天達(dá)到頂峰，而后大型溞種群數(shù)量因環(huán)境承載能力的不足而減少，并在第30～50天達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。在第50天以后，大型溞數(shù)量因系統(tǒng)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡而不斷下降。在試驗(yàn)早期，不同銅離子濃度處理組中大型溞數(shù)量均處于較低水平。在試驗(yàn)后期，由于銅離子濃度的降低，最低濃度組的大型溞表現(xiàn)出恢復(fù)的趨勢，而其他兩個(gè)濃度組的大型溞仍未見數(shù)量增長。

(2)輪蟲豐度變化

微宇宙中萼花臂尾輪蟲豐度的變化如圖2(b)所示。由圖中可以看出在接種后的1周內(nèi)，各濃度組的輪蟲豐度均增大，空白對(duì)照組增加的輪蟲數(shù)量遠(yuǎn)高于其他處理組。接種的1周后，空白對(duì)照組和處理組中輪蟲豐度均迅速下降。雖然溞類攝食和銅離子毒性均可導(dǎo)致輪蟲增長停滯，但空白對(duì)照組輪蟲豐度的快速下降證實(shí)溞類攝食的影響更加直接。銅離子處理組在極低的大型溞豐度下出現(xiàn)的輪蟲豐度下降可能主要由高濃度銅離子的生物毒性所導(dǎo)致。此后空白對(duì)照組輪蟲豐度在第42～49天、第56～63天出現(xiàn)小幅度的增長，110.80 μg·L-1處理組輪蟲保持相對(duì)穩(wěn)定的豐度，其他處理組在整個(gè)試驗(yàn)期間的豐度接近零且沒有增長。

(3) 藻類豐度變化

微宇宙中各種藻類的豐度變化如圖3所示?？傮w而言，四尾柵藻和小球藻的豐度變化范圍較大，斜生柵藻次之，羊角月牙藻最小。這可能由藻類對(duì)微宇宙環(huán)境適應(yīng)程度和敏感度不同所導(dǎo)致。此外，在整個(gè)試驗(yàn)周期中，空白對(duì)照組中4種藻類豐度均低于受試組，而不同濃度處理組藻類豐度則呈現(xiàn)出不同的規(guī)律：所有處理組四尾柵藻豐度隨銅離子濃度升高而降低；212.06和420.26 μg·L-1處理組斜生柵藻豐度相似，均高于110.80 μg·L-1處理組；所有處理組羊角月牙藻豐度變化規(guī)律與斜生柵藻相似，與銅離子濃度無顯著相關(guān)性；處理組小球藻豐度前期與空白對(duì)照組無顯著差異，后期(46 d后)隨銅離子濃度升高而升高。對(duì)比微宇宙中溞類豐度變化規(guī)律可知，較高的溞類捕食壓力是導(dǎo)致空白對(duì)照組藻類豐度普遍偏低的直接原因。而處理組在較低的溞類捕食壓力下仍呈現(xiàn)出不同的銅離子濃度相關(guān)性可能與溞類捕食選擇性和藻類對(duì)銅離子危害響應(yīng)敏感性差異有關(guān)。根據(jù)本試驗(yàn)測試結(jié)果可推斷，處理組中大型溞傾向于優(yōu)先捕食斜生柵藻和小球藻，而四尾柵藻豐度的降低主要?dú)w因于銅離子的生物毒性作用。

圖2 試驗(yàn)期間大型溞和輪蟲豐度的變化

圖3 微宇宙中藻類豐度變化

圖4 微宇宙中總藻豐度和葉綠素a濃度的變化

微宇宙中總藻豐度和葉綠素a的變化如圖4所示。由圖4(a)可知，空白對(duì)照組總藻豐度在整個(gè)周期內(nèi)都低于各個(gè)處理組，且在試驗(yàn)中期(2849 d)相對(duì)平穩(wěn)、在后期(49 d后)略有增長。銅離子對(duì)總藻豐度的影響呈現(xiàn)出與四尾柵藻相似的濃度-效應(yīng)關(guān)系，主要是因?yàn)樗奈矕旁遄鳛檎麄€(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)的主要優(yōu)勢藻種，掩蓋了其他藻類數(shù)量的微弱變化；在試驗(yàn)后期，110.80 μg·L-1銅離子暴露濃度下的藻類數(shù)量由于大型溞種群的恢復(fù)而先于其他濃度組下降，其他濃度組中的藻類數(shù)量因?yàn)殂~離子實(shí)際濃度的降低和營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡而表現(xiàn)出先增長后下降的趨勢。圖4(b)呈現(xiàn)一種與圖4(a)顯著不同的規(guī)律：從第35天開始，空白對(duì)照組中葉綠素a含量明顯上升，此時(shí)可明顯觀察到空白對(duì)照組缸壁上開始長出固著藻類。由于固著藻類數(shù)量體現(xiàn)在葉綠素a的測定結(jié)果中且未體現(xiàn)在總藻豐度的測定結(jié)果中，所以推斷此時(shí)的固著藻類已成為空白對(duì)照組中的優(yōu)勢種群。處理組未觀察到固著藻類的生長，鑒于溞類對(duì)固著藻類的捕食難度，這可能反映了銅離子對(duì)固著藻類的生長抑制效應(yīng)。

2.1.3 理化指標(biāo)

(1)微宇宙中溶解氧的變化

圖5展示了微宇宙中光合作用產(chǎn)氧量P和呼吸作用耗氧量R及其比值在整個(gè)試驗(yàn)期間的變化。R值反映了生態(tài)群落呼吸作用消耗的有機(jī)物質(zhì)的量，P值反映了植物光合作用有機(jī)物質(zhì)的合成量減去呼吸作用消耗的有機(jī)物質(zhì)之后的凈初級(jí)生產(chǎn)量。而生產(chǎn)量與消耗量之比(P/R)可以反映群落的代謝水平，P/R越大，群落生產(chǎn)力越高。由圖5可知，P和R表現(xiàn)出相似的規(guī)律：在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，420.26 μg·L-1處理組P和R均低于空白對(duì)照組，而其他處理組與空白對(duì)照組無顯著差異。由圖5(c)可知，所有處理組的P/R變化幾乎一致：前35天均在1上下小范圍內(nèi)波動(dòng)，在第35天到42天由于R的快速下降而上升，其后經(jīng)過一段時(shí)間的平穩(wěn)期，試驗(yàn)結(jié)束前一周由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡而下降。

(2)pH

圖5(d)展示了不同處理組pH值隨時(shí)間的變化。pH值反映了系統(tǒng)內(nèi)部化學(xué)環(huán)境的改變，可作為外源脅迫對(duì)生態(tài)系統(tǒng)功能影響程度的指標(biāo)。由圖中可以看出不同濃度組pH值的數(shù)值高低排列與總藻豐度的變化曲線(圖4(a))相吻合，表明pH值與藻類的數(shù)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性：藻類濃度越大，pH值越高。這主要是藻類生長大量消耗水中碳酸氫根離子引起的[26]。

圖5 微宇宙理化指標(biāo)的變化

2.1.4 微宇宙系統(tǒng)危害綜合評(píng)估

空白對(duì)照組和受試組的物種豐度和理化指標(biāo)進(jìn)行的單因素方差分析結(jié)果見表2。由表中可以看出，處理組大型溞豐度在各個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)均比對(duì)照組顯著降低，且LOEC在試驗(yàn)14 d49 d內(nèi)均維持在110.80 μg·L-1；但在試驗(yàn)后期(56 d以后)LOEC由110.80 μg·L-1升至212.06 μg·L-1。這說明銅離子生物毒性是導(dǎo)致大型溞種群變化的主要因素，后期由于銅離子實(shí)際濃度的降低促進(jìn)了溞類種群的恢復(fù)。其它生物豐度僅在某些監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。值得注意的是，處理組葉綠素a濃度顯著低于對(duì)照組，而處理組的各種藻類豐度及其總量卻顯著高于對(duì)照組。由于藻類及總量豐度僅涉及水中藻類(小球藻、羊角月牙藻、斜生柵藻和四尾柵藻)，而葉綠素a的濃度同時(shí)涵蓋固著藻類和其他藻類，因此對(duì)比大型溞豐度與銅離子暴露濃度的關(guān)系可知，水中藻類(不包括固著藻類)生長受抑制主要?dú)w因于大型溞攝食壓力，而溞類對(duì)固著藻類的攝食難度導(dǎo)致銅離子毒性成為葉綠素a濃度隨處理濃度升高而降低的主要原因。

從功能性指標(biāo)來看，處理組pH均顯著高于對(duì)照組，這與水中藻類(不包括固著藻類)豐度的變化規(guī)律比較一致。因此除固著藻類之外的水中藻類種群是影響本系統(tǒng)pH變化的主要因素。與空白對(duì)照組相比，處理組P/R在28 d和56 d趨勢相反，原因可能是28 d和56 d時(shí)作為系統(tǒng)主要生產(chǎn)者的藻類和作為主要消費(fèi)者的大型溞的相對(duì)豐度的變化。

從系統(tǒng)整體水平來看，綜合考慮物種豐度和系統(tǒng)功能性指標(biāo)，銅離子對(duì)微宇宙756 d-NOEC均低于110.80 μg·L-1，63 d-NOEC為110.80 μg·L-1，反映了試驗(yàn)后期系統(tǒng)群落的恢復(fù)。

2.2 物種敏感度分布曲線法評(píng)估HC5值

表3為使用不同模型的HC5值擬合結(jié)果。從表中可以看出，各個(gè)模型的擬合效果均較好，R2均達(dá)到0.99以上。采用Weibull模型的擬合度最高，為0.9957，由此推導(dǎo)出的銅離子的HC5值為3.278 μg·L-1。

表2 不同終點(diǎn)在各取樣日期的LOECs (Dennett’s test,P<0.05)Table 2 LOECs for different endpoints (Dennett’s test,P<0.05) per sampling date

注:a和對(duì)照組相比數(shù)量顯著上升(↑)或下降(↓)；b無明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系；NOEC的單位為μg·L-1。

Note:aPopulations were significantly reduced (↓) or increased (↑) compared to blank control；bNo significant effect-dose relationship；the unit of NOEC is μg·L-1.

表3 不同擬合模型推導(dǎo)出的HC5值Table 3 HC5 values derived from different models

3 討論(Discussion)

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，生產(chǎn)者、消費(fèi)者和分解者共同構(gòu)成了一個(gè)相互依存、動(dòng)態(tài)平衡的體系。當(dāng)外源脅迫打破這種平衡時(shí)，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定就會(huì)受到影響[27]。在本試驗(yàn)微宇宙系統(tǒng)中，藻類作為生產(chǎn)者，可以為其中的消費(fèi)者(大型溞和輪蟲)提供食物來源，而大型溞和輪蟲在捕食藻類的同時(shí)又構(gòu)成捕食關(guān)系。因此，本系統(tǒng)可以在一定程度上反映種群間的捕食及競爭關(guān)系。在空白對(duì)照中，大型溞豐度與藻類豐度呈現(xiàn)此消彼長的關(guān)系，而銅離子處理組由于抑制了大型溞的存活和繁殖，導(dǎo)致了藻類和輪蟲豐度的增長；同時(shí)，較高濃度的銅離子也抑制了固著藻類和輪蟲豐度的增長；在試驗(yàn)的后期，暴露最低濃度銅離子的系統(tǒng)表現(xiàn)出恢復(fù)的趨勢：大型溞豐度的增長和藻類豐度的降低，表明在低濃度銅離子暴露下生態(tài)系統(tǒng)具有一定的反饋調(diào)節(jié)功能；而隨著銅離子濃度的升高，生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)越困難，這與Harrass和Taub[28]的研究結(jié)果一致。

銅離子作為國際上普遍采用的微宇宙危害測試陽性對(duì)照物，本研究獲取的銅離子對(duì)微宇宙的63 d-NOEC為110.80 μg·L-1，危害評(píng)估結(jié)果與Harrass和Taub[28]及Meador等[29]的微宇宙測試結(jié)果一致。同SSD法推導(dǎo)出的HC5值相比較，本研究獲取的銅離子對(duì)微宇宙的63 d-NOEC值較高。造成差異的原因可能是兩點(diǎn)：首先，不同試驗(yàn)方法下有效作用于生物體的銅離子到達(dá)濃度有所差異。一是由于微宇宙系統(tǒng)中包括多種環(huán)境介質(zhì)，銅離子各相濃度存在動(dòng)態(tài)平衡；二是本研究作為靜態(tài)試驗(yàn)，銅離子濃度不斷降低，在第63天時(shí)實(shí)際銅離子濃度僅約為6080 μg·L-1，而查閱到的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)多是來自半靜態(tài)的或流動(dòng)的試驗(yàn)系統(tǒng)，其濃度相對(duì)穩(wěn)定，所以求出的HC5值相對(duì)較低。其次，微宇宙系統(tǒng)可以模擬單一物種毒性試驗(yàn)所不具備的種間關(guān)系和反饋機(jī)制，所以會(huì)與單一物種毒性數(shù)據(jù)的外推結(jié)果存在較大差異。Wijngaarden等[30]對(duì)1980—2001年期間公開發(fā)布的農(nóng)藥對(duì)微宇宙和單一物種毒性測試結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)毒死蜱、殺螟硫磷、胺甲萘等10種農(nóng)藥對(duì)微宇宙的NOEC為其對(duì)單一敏感物種(溞類或魚類)EC50的10%～500%；同時(shí)，該研究小組[24]還分別利用微宇宙和單一物種測試評(píng)估了氟啶胺的毒性：將單一物種急性毒性測試結(jié)果(EC50或EC10)利用物種敏感度分布曲線外推的HC5與微宇宙測試計(jì)算出的系統(tǒng)NOEC進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明基于EC10和EC50的HC5值95%置信區(qū)間下限均低于模擬系統(tǒng)群落NOEC，而基于EC50的HC5值比模擬系統(tǒng)群落NOEC稍高；此外，Vervliet等[31]、Broise等[27]及Schramm等[32]的研究也反映出微宇宙系統(tǒng)與單一物種毒性試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異。這些差異均反映了微宇宙危害評(píng)估結(jié)果與傳統(tǒng)的單一物種毒性試驗(yàn)結(jié)果之間不存在簡單的外推關(guān)系。水生微宇宙作為歐美等發(fā)達(dá)國家或地區(qū)公認(rèn)的化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)層級(jí)評(píng)估體系中高級(jí)別化學(xué)品生態(tài)危害評(píng)估技術(shù)，為了實(shí)現(xiàn)其對(duì)單一物種毒性測試的有效補(bǔ)充和驗(yàn)證作用，需要進(jìn)一步規(guī)范其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方法以增強(qiáng)微宇宙數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，同時(shí)進(jìn)一步探索受試化學(xué)品在系統(tǒng)各相間分布和轉(zhuǎn)化規(guī)律、充分揭示微宇宙宏觀響應(yīng)的機(jī)制。

微宇宙體系以真實(shí)的自然系統(tǒng)為模擬對(duì)象，反映出化學(xué)品暴露下的生態(tài)功能及種間關(guān)系的變化，以此為基礎(chǔ)的生態(tài)危害評(píng)估更接近實(shí)際、并可以降低單一物種毒性測試數(shù)據(jù)的不確定性。本文的研究結(jié)果一方面為波爾多液等含銅離子的殺菌劑、除藻劑生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和安全性使用提供數(shù)據(jù)支持；另一方面也可以為進(jìn)一步規(guī)范化微宇宙測試方法、開發(fā)包含更為復(fù)雜物種系統(tǒng)的微宇宙測試技術(shù)提供參照。然而由于本研究構(gòu)建的微宇宙系統(tǒng)僅包含浮游藻類、輪蟲和大型溞等浮游類生物，未囊括底棲生物和微生物群落，因此對(duì)銅離子在底泥中沉積所造成的危害評(píng)估考慮不足，后期須嘗試構(gòu)建涵蓋更多生態(tài)位生物的微宇宙系統(tǒng)開展進(jìn)一步研究。

[1] 姚薇,王一喆.化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估制度建設(shè)進(jìn)展和建議[J].環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報(bào),2011,1(5): 431-437

Yao W,Wang Y Z.Development and suggestions on chemical risk assessment system establishment [J].Journal of Environmental Engineering Technology,2011,1(5): 431-437 (in Chinese)

[2] 雷炳莉,黃圣彪,王子健.生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)理論和方法[J].化學(xué)進(jìn)展,2009,21(2-3): 350-358

Lei B L,Huang S B,Wang Z J.Theories and methods of ecological risk assessment [J].Progress in Chemistry,2009,21(2-3): 350-358 (in Chinese)

[3] Posthuma L,Traas T P,Suter G W II.General Introduction to Species Sensitivityity Distributions.[M]// Posthuma L,Suter G W II,Traas T P (Ed.).Species Sensitivity Distributions in Ecotoxicology.Boca Raton: CRC Press,2002: 5-7

[4] González-Pleiter M,Gonzalo S,Rodea-Palomares I,et al.Toxicity of five antibiotics and their mixtures towards photosynthetic aquatic organisms: Implications for environmental risk assessment [J].Water Research,2013,47(6): 2050-2064

[5] Cairns J.The myth of the most sensitive species [J].BioScience,1986,36(10): 670-672

[6] Zhu H,Wang Y,Tam N F Y.Microcosm study on fate of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in contaminated mangrove sediment [J].Journal of Hazardous Materials,2014,265: 61-68

[7] Regier N,Larras F,Bravo A G,et al.Mercury bioaccumulation in the aquatic plant Elodea nuttallii in the field and in microcosm: Accumulation in shoots from the water might involve copper transporters [J].Chemosphere,2013,90(2): 595-602

[8] United States Environmental Protection Agency.OPPTS 850.1900 Generic Freshwater Microcosm Test,Laboratory [S].Washington DC: US EPA,1996

[9] American Society for Testing and Materials.E1366-96 Standard Practice for Standardized Aquatic Microcosms Fresh Water [S].Philadelphia: ASTM,2003

[10] Organization for Economic Co-operation and Development.Guidance Document on Simulated Freshwater Lentic Field Tests (Outdoor Microcosms and Mesocosms) [S].Paris: OECD,2004

[11] Wijngaarden R P A.Interpretation and Extrapolation of Ecological Responses in Model Ecosystems Stressed with Non-persistent Insecticides [M].Wageningen: Alterra,2006: 33-235

[12] 徐鏡波,梁林.1,4-二硝基苯對(duì)藻型塘微宇宙的影響[J].東北師大學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2002,34(3): 108-112

[13] 吳穎慧,蔡磊明,王捷,等.莠去津?qū)?biāo)準(zhǔn)化水生微宇宙的影響[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,10(3): 343-348

Wu Y H,Cai L M,Wang J,et al.The effect of atrazine on standardized aquatic microcosm [J].Chinese Journal of Pesticide Science,2008,10(3): 343-348 (in Chinese)

[14] 張毅敏,金洪鈞.EDTA對(duì)Cu參水生微宇宙中的毒性和分布的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),1999,10(4): 485-488

Zhang Y M,Jin H J.Effect of EDTA on toxicity and distribution of Cu in aquatic microcosm [J].Chinese Journal of Applied Ecology,1999,10(4): 485-488 (in Chinese)

[15] 王穎,王琳,魯翌,等.次氯酸鈉對(duì)池塘微宇宙結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].衛(wèi)生研究,2007,36(2): 144-147

Wang Y,Wang L,Lu Y,et al.Effects of sodium hypochlorite on structure and function of pond microcosms [J].Journal of Hygiene Research,2007,36(2): 144-147 (in Chinese)

[16] 金洪鈞,孫麗偉.實(shí)驗(yàn)室水生微宇宙的組建和基本生態(tài)學(xué)過程[J].南京大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,1992 (1): 98-106

[17] 種云霄,湯仲恩,余光偉,等.銅離子對(duì) 2 種沉水植物種植水抑藻效應(yīng)的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2012,21(9): 1594-1598

Zhong Y X,Tang Z E,Yu G W,et al.Growth inhibition of blue-green algae by submerged macrophytes culture solutions with existence of the low level of copper ion [J].Ecology and Environmental Sciences,2012,21(9): 1594-1598 (in Chinese)

[18] Taub F B,Kindig A C,Conquest L L.Preliminary results of interlaboratory testing of a standardized aquatic microcosm [J].Community Toxicity Testing,ASTM STP,1986,920: 93-120

[19] US EPA．ECOTOX Database [EB/OL]．http://cfpub.epa.gov/ecotox/

[20] OECD.The Global Portal to Information on Chemical Substances [DB/OL].http://www.echemportal.org/echemportal/

[21] 王宏,楊霓云,余若禎,等.我國新化學(xué)物質(zhì)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)外推技術(shù)探討[J].環(huán)境科學(xué)研究,2009,22(7): 805-809

Wang H,Yang N Y,Yu R Z,et al.Research on extrapolation techniques of eco-environmental risk assessment for new chemicals in China [J].Research of Environmental Sciences,2009,22(7): 805-809

[22] 松遼流域水環(huán)境監(jiān)測中心.SL88-2012 水質(zhì)葉綠素的測定-分光光度法[S].北京: 中國水利水電出版社,2012

[23] 環(huán)境保護(hù)部化學(xué)品登記中心.GB/T 21828-2008化學(xué)品大型溞繁殖試驗(yàn)[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008

[24] Wijngaarden R P A,Arts G H P,Belgers J D M,et al.The species sensitivity distribution approach compared to a microcosm study: A case study with the fungicide fluazinam [J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2010,73(2): 109-122

[25] 賈鵬.含有機(jī)絡(luò)合劑的重金屬廢水生化處理研究[D].南京: 南京理工大學(xué),2013: 1-4

Jia P.Study on heavy metal wastewater containing organic complexing agent by biochemical treatment [D].Nanjing: Nanjing University of Science and Technology,2013: 1-4

[26] Organization for Economic Co-operation and Development.OECD Series on Testing and Assessment NO.23 Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures [S].Paris: OECD,2000

[27] De La Broise D,Stachowski-Haberkorn S.Evaluation of the partial renewal of in situ phytoplankton microcosms and application to the impact assessment of bentazon and dimethenamid [J].Marine Pollution Bulletin,2012,64(11): 2480-2488

[28] Harrass M C,Taub F B.Comparison of laboratory microcosms and field responses to copper [M] // Boyle T P.Validation and Predictability of Laboratory Methods for the Assessment of Fate and Effects of Environmental Contaminants in Aquatic Ecosystems.Philadelphia: ASTM STP,1985,865: 57-74

[29] Meador J P,Taub F B,Sibley T H.Copper dynamics and the mechanism of ecosystem level recovery in a standardized aquatic microcosm [J].Ecological Applications,1993,3 (1): 139-155

[30] Wijngaarden R P A ,Brock T C M,Van Den Brink P J.Threshold levels for effects of insecticides in freshwater ecosystems: A review [J].Ecotoxicology,2005,14(3): 355-380

[31] Vervliet-Scheebaum M,Straus A,Tremp H,et al.A microcosm system to evaluate the toxicity of the triazine herbicide simazine on aquatic macrophytes [J].Environmental Pollution,2010,158(2): 615-623

[32] Schramm K W,Jaser W,Welzl G,et al.Impact of 17a-ethinylestradiol on the plankton in freshwater microcosms I: Response of zooplankton and abiotic variables [J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2008,69: 437-452

◆

A Microcosm Study Compared to the Species Sensitivity Distribution Approach: A Case Study with the Copper Ion

Liu Jianmei1,2,Wang Lei2,Liu Jining2,Shi Lili2,#,Chen Yingwen1,*,Shen Shubao1

1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China 2.Nanjing Institute of Environmental Sciences,MEP,Nanjing 210042,China

28 November 2014 accepted 16 March 2015

To compare the differences between microcosm study and species sensitivity distribution approach in ecological hazard assessment of copper ion,a microcosm system contained planktonic algae,rotifers and daphnia was built and the dynamics of copper ion concentration,species abundances and physicochemical properties of the system were monitored for 63 d.And on this basis the 63 d-NOEC (no observed effect concentration) of copper ion for the microcosm system was calculated.In the meantime,species sensitivity distribution curves were constructed with chronic toxicity data for fish,crustacean,insects,algae and mollusk,which gave a no obvious hazard concentration for 95% species in the ecosystem (HC5).According to test results,Daphnia magna had disappeared for a short time at 110.80 μg·L-1treatment,which led to the increase of rotifers and algae abundances.However,in the later period of the test the recovery of Daphnia magna was observed at 110.80 μg·L-1treatment due to the decrease of the measured copper ion concentration.While for 212.06 and 420.26 μg·L-1treatments,the survival of rotifers and algae were strongly inhibited and no recovery had been observed till the end of test.Compared to HC5value calculated by the species sensitivity distribution approach,the 63 d-NOEC derived from microcosm study was much higher than HC5.Possible causes might be the different bio-availability of copper ion in different phases of medium and the interspecies feedback included in the microcosm.

copper ion; microcosm; species sensitivity distribution; ecological hazard

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2013AA06A308)；PBT/PvB分類技術(shù)體系及智能篩選平臺(tái)開發(fā)(科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項(xiàng))

劉建梅(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理測試，E-mail: liulaoda08@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: ywchen@njtech.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141128001

2014-11-28 錄用日期：2015-03-16

1673-5897(2015)4-034-13

X171.5

A

陳英文(1978-)，男，博士，副教授，主要從事環(huán)境科學(xué)及工程的研究。

石利利(1965-)，女，碩士，研究員，主要從事化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究工作。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author),E-mail: sll@nies.org

劉建梅,王蕾,劉濟(jì)寧,等.微宇宙技術(shù)和物種敏感度分布曲線法評(píng)估銅離子生態(tài)危害比對(duì)研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015,10(4): 34-46

Liu J M,Wang L,Liu J N,et al.A microcosm study compared to the species sensitivity distribution approach: A case study with the copper ion [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 34-46(in Chinese)