質(zhì)譜儀在真菌鑒定中的應(yīng)用與評(píng)價(jià)

王歡，賈天野，鮑春梅，張成龍，張鞠玲，崔恩博，陳素明，徐東平，曲芬

質(zhì)譜儀在真菌鑒定中的應(yīng)用與評(píng)價(jià)

王歡，賈天野，鮑春梅，張成龍，張鞠玲，崔恩博，陳素明，徐東平，曲芬

目的探討質(zhì)譜儀在真菌感染中的應(yīng)用，評(píng)價(jià)其鑒定真菌的能力。方法選取分離自我院住院患者的真菌菌株327株，用質(zhì)譜儀進(jìn)行快速鑒定，并與VITEK-2（酵母樣真菌）和顯微鏡檢查（絲狀真菌）的鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，差異結(jié)果用分子生物學(xué)方法確認(rèn)鑒定。結(jié)果依照質(zhì)譜儀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，227株酵母樣真菌在種水平（>2.0）的鑒定率為90.31%，在屬水平（>1.7）為98.68%；絲狀真菌在種水平的鑒定率為74.00%，在屬水平為94.00%。對(duì)臨床常見的曲霉菌鑒定正確率可達(dá)96.74%。結(jié)論質(zhì)譜儀在鑒定真菌的種屬水平上都達(dá)到了令人滿意的結(jié)果，尤其鑒定酵母菌和曲霉菌的能力更為突出，可作為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)方法。

光譜法，質(zhì)量，基質(zhì)輔助激光解吸電離；真菌；感染

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用、器官移植以及導(dǎo)管技術(shù)的開展，腫瘤患者和接受免疫抑制劑治療者逐年增多，真菌感染（如假絲酵母菌屬、隱球菌屬和曲霉屬等）成為危及這類患者健康的主要因素之一。很多真菌生長(zhǎng)緩慢，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，一般為3～10 d，給早期診斷和針對(duì)性治療帶來困難，導(dǎo)致真菌感染死亡率升高[1]。目前，多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室仍采用傳統(tǒng)的鑒定方法進(jìn)行真菌鑒定，但真菌的出現(xiàn)日益多樣化，使鑒定真菌病原體難度不斷增大，傳統(tǒng)鑒定方法已顯不足，尤其對(duì)不常見的疑難真菌[2]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是近年來新興的菌種鑒定技術(shù)，可通過直接檢測(cè)生物標(biāo)志物（蛋白）鑒定病毒、細(xì)菌、真菌及分枝桿菌[3-6]，具有高敏感性、高通量和快速的特點(diǎn)。為探討質(zhì)譜儀在真菌感染診斷中的應(yīng)用，評(píng)價(jià)其鑒定真菌的能力，特進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料從2011年1月—2014年12月分離自我院住院患者的真菌菌株中選取227株酵母樣真菌和100株絲狀真菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑主要為沙保弱瓊脂平板（Oxoid公司，英國）、PDA培養(yǎng)基（Oxoid公司，英國）、需氧培養(yǎng)瓶（北京伯泰生物技術(shù)有限公司）、酵母菌鑒定卡（法國生物梅里埃股份有限公司）、棉藍(lán)染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、HCCAα-氰基-4-羥基肉桂酸（布魯克公司，德國）、無水乙醇、乙腈及甲酸（Fisher Scientific，美國）、ITS4（華大基因）、ITS5（華大基因）、Premix Taq Version 2.0（TaKaRa，日本）、玻璃珠法柱式真菌DNAout（北京天恩澤基因科技有限公司）、Regular Agarose G-10（Biowest，西班牙）、50×TAE（北京索萊寶科技有限公司）、90mm平板（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）、1.5ml離心管（Axygen，美國）、15ml離心管（浙江拱東醫(yī)療科技有限公司）和PCR管（Axygen，美國）。

1.2.2 儀器主要有質(zhì)譜儀Microflex（布魯克公司，德國）、VITEK-2全自動(dòng)鑒定儀（法國生物梅里埃股份有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、霉菌培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）、高速離心機(jī)（Thermo，美國）、PCR儀（BIO-RAD，美國）、電泳儀（BIO-RAD，美國）和凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1.3 培養(yǎng)將菌株接種于沙保弱瓊脂平板上，酵母樣真菌置于35℃孵箱培養(yǎng)24～48 h，絲狀真菌置28℃孵箱培養(yǎng)48 h。

1.4 真菌鑒定

1.4.1 酵母樣真菌

1.4.1.1 質(zhì)譜儀鑒定將1μl菌落加在300μl無菌蒸餾水中懸浮，再加入900μl無水乙醇混勻，將樣品高速離心（13 000 r/min）2min，棄去上清液；在沉淀中加入70%甲酸50μl和乙腈50μl充分混勻，將樣品再高速離心2min；將1μl上清點(diǎn)在MALDI靶板上，干燥后覆蓋1μl基質(zhì)溶液（飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸、50%乙腈和2.5%三氟酸溶液），在室溫下結(jié)晶風(fēng)干，用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。使用FlexControl3.0軟件采集圖譜，采用氮基光源及線性陽離子檢測(cè)模式，加速電壓20 kv，延遲提取電壓16.80 v，延遲時(shí)間為130 ns，激光發(fā)射電壓2500mv,激光頻率為40Hz，每個(gè)靶點(diǎn)設(shè)激光隨機(jī)射擊100個(gè)點(diǎn)，每次射擊5次，m/z的采集范圍為2～20 kDa[7-8]。用MALDIBiotyper 3.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)，得出鑒定結(jié)果。每株菌點(diǎn)3個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行平行檢測(cè)，取評(píng)分最高的點(diǎn)計(jì)入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.4.1.2 VITEK-2鑒定用無菌棉簽挑取純培養(yǎng)的酵母樣菌落，混懸于0.45%的Nacl溶液中，配成1.8～2.2McF，用酵母菌鑒定卡（YST）按照VITEK-2全自動(dòng)鑒定儀操作步驟進(jìn)行鑒定。

1.4.2 絲狀真菌

1.4.2.1 質(zhì)譜儀鑒定用在蒸餾水中浸濕的無菌拭子，刮取培養(yǎng)48 h的絲狀真菌菌落，在300μl蒸餾水中懸浮，菌液渾濁后再加入900μl無水乙醇混勻，將樣品高速離心2min，棄去上清液，在孵箱中干燥2min；在沉淀中加入70%甲酸100μl和乙腈100μl充分混勻，將樣品再高速離心2min。后續(xù)操作步驟同1.4.1.1。

1.4.2.2 顯微鏡檢查將絲狀真菌點(diǎn)種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用透明膠帶粘取絲狀真菌表面，置于滴有棉蘭染液的玻片上，在顯微鏡下觀察孢子和分生孢子的形態(tài)、生長(zhǎng)方式及菌絲特征等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[9]。

1.4.3 真菌陽性瓶鑒定初步涂片確定為真菌的胸腹水及引流液標(biāo)本陽性培養(yǎng)瓶，吸取10ml陽性瓶中液體或絲狀真菌的菌團(tuán)，放入15ml離心管中3500 r/min離心10min，將沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入1ml蒸餾水，充分混勻后高速離心2min，棄去上清液。沉淀按照上述質(zhì)譜儀鑒定的方法進(jìn)行操作。

1.4.4 分子生物學(xué)鑒定真菌菌株按照玻璃珠法柱式真菌DNAout試劑盒操作方法提取DNA，選擇真菌鑒定通用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）進(jìn)行擴(kuò)增[10]。PCR反應(yīng)體系參照Premix試劑說明書配制。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察是否有條帶。目的片段進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序拼接結(jié)果利用BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定鑒定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用Excel2003軟件建立數(shù)據(jù)庫，用描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，計(jì)算相應(yīng)的發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 酵母樣真菌227株酵母樣真菌質(zhì)譜鑒定結(jié)果為：白假絲酵母菌70株，克柔假絲酵母菌32株，熱帶假絲酵母菌35株，光滑假絲酵母菌46株，近平滑假絲酵母菌10株，季也蒙假絲酵母菌6株，角膜假絲酵母菌4株，葡萄牙假絲酵母菌9株，新型隱球菌6株，似平滑假絲酵母菌2株，擬平滑假絲酵母菌1株，乳酒假絲酵母菌2株，挪威假絲酵母菌1株，阿薩希毛孢子菌1株，未出結(jié)果2株，其中鑒定錯(cuò)誤1株。質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果與VITEK-2鑒定結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有21株有差異，經(jīng)分子生物學(xué)方法確定20株與質(zhì)譜結(jié)果相同，1株與VITEK-2結(jié)果相同。質(zhì)譜未出結(jié)果的菌中1株為皺褶假絲酵母菌，1株為季也蒙假絲酵母菌，將1株奧默柯達(dá)菌錯(cuò)誤鑒定為季也蒙假絲酵母菌?？傮w鑒定率為98.68%（224/227）。質(zhì)譜未鑒定出的1株季也蒙假絲酵母菌，VITEK-2鑒定正確，其鑒定率為90.31%（205/ 227）。質(zhì)譜鑒定正確率高于VITEK-2。質(zhì)譜與VITEK-2的鑒定結(jié)果比對(duì)見表1。

根據(jù)質(zhì)譜說明書判斷結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)為評(píng)分＞2.0在種水平可信，1.7～2.0在屬水平可信。226株酵母樣真菌（不包含鑒定錯(cuò)誤的1株菌）的質(zhì)譜評(píng)分結(jié)果見表2，達(dá)到種水平的鑒定率為90.31%（205/ 227），達(dá)到屬水平為98.68%（224/227）。

表1 酵母樣真菌鑒定結(jié)果比對(duì)（株）Table 1 Comparison of the results of the identification of yeast-like fungi(strains)

表2 酵母樣真菌的質(zhì)譜鑒定評(píng)分結(jié)果（株）Table 2 Scores of the identification of yeast-like fungi by mass spectrometry(strains)

2.2 絲狀真菌質(zhì)譜鑒定臨床分離的絲狀真菌共100株，鑒定結(jié)果為煙曲霉菌70株，黃曲霉菌15株，黑曲霉菌5株，白地霉菌1株，茄病鐮刀菌1株，米曲霉菌2株，青霉菌3株，未出結(jié)果3株，分別為總狀毛霉菌、粗糙脈孢菌和棘孢木霉。經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定和分子生物學(xué)方法驗(yàn)證后，有3株鑒定錯(cuò)誤，鑒定率為94.00%（94/100），曲霉菌的鑒定正確率為96.74%（89/92）。見表3。

質(zhì)譜鑒定結(jié)果評(píng)分＞2.0的為74株，1.7～2.0為20株，達(dá)到種水平的鑒定率為74.00%（74/100），達(dá)到屬水平為94.00%（94/100）。97株絲狀真菌（不包含鑒定錯(cuò)誤的3株菌）的質(zhì)譜評(píng)分結(jié)果見表4。

表3 絲狀真菌鑒定結(jié)果比對(duì)（株）Table 3 Comparison of the results of the identification of filamentous fungi(strains)

表4 絲狀真菌質(zhì)譜評(píng)分結(jié)果（株）Table 4 Scores of the identification of filamentous fungi by mass spectrometry(strains)

2.3 真菌質(zhì)譜圖譜不同真菌圖譜中的特異峰不同（圖1）。

圖1 部分酵母樣真菌質(zhì)譜圖Figure 1 M ass spectrum of yeast-like fungi

2.4 真菌陽性培養(yǎng)瓶的鑒定本實(shí)驗(yàn)從初步涂片確定為真菌的陽性培養(yǎng)瓶中直接提取菌種蛋白，用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)8例，除1例為混合感染未提取到有效菌種蛋白鑒定失敗，其余7例均與培養(yǎng)后鑒定結(jié)果一致，菌種類別分別為白假絲酵母菌4株，黃曲霉菌1株，近平滑假絲酵母菌1株，光滑假絲酵母菌1株。

2.5 鑒定用時(shí)質(zhì)譜儀可在菌種鑒定當(dāng)日得出結(jié)果，平均用時(shí)20min；VITEK-2鑒定酵母樣真菌需要24～48 h，絲狀真菌鑒定需要在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d才能在鏡下看到理想的形態(tài)；分子生物學(xué)方法需經(jīng)過測(cè)序得到鑒定結(jié)果，也要經(jīng)過24～48 h。所以質(zhì)譜儀是目前真菌鑒定方法中用時(shí)最短，操作也相對(duì)簡(jiǎn)便的方法。

3 討論

真菌感染已成為臨床抗感染治療的棘手問題，早期、快速、準(zhǔn)確的診斷是及時(shí)救治的關(guān)鍵[11]。全球每年約有7280萬例假絲酵母菌感染；在美國，假絲酵母菌感染是院內(nèi)血流感染致死的重要因素，其中白假絲酵母菌成為最重要的致病真菌[2]。目前，臨床常用的酵母樣真菌鑒定方法有科瑪嘉顯色培養(yǎng)法、VITEK-2和API AUX鑒定法，對(duì)常見酵母樣真菌（白假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌）的鑒定正確率可達(dá)到92%～96%[12]，但對(duì)某些酵母樣真菌鑒定準(zhǔn)確度低，如不能準(zhǔn)確鑒定格特隱球菌[13]。鑒定絲狀真菌常采用PDA培養(yǎng)后，顯微鏡鏡下觀察形態(tài)特點(diǎn)和產(chǎn)孢方式，并結(jié)合菌落生長(zhǎng)形態(tài)和顏色等，要求檢驗(yàn)人員有豐富的絲狀真菌鑒定經(jīng)驗(yàn)，易產(chǎn)生人為誤差，且操作時(shí)對(duì)環(huán)境易造成污染。分子生物學(xué)方法是目前公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]，但其操作步驟繁瑣，單株菌的前處理需1 h，鑒定需24～48 h，對(duì)操作人員的要求高，易受到污染導(dǎo)致鑒定失敗。

質(zhì)譜技術(shù)是近年研究的熱點(diǎn)，以高通量、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)受到微生物實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注。不同菌的蛋白表達(dá)不同，通過質(zhì)譜儀得到的蛋白質(zhì)圖譜也不同，將待測(cè)菌的蛋白圖譜和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)圖譜的匹配度，得出鑒定結(jié)果和相應(yīng)的鑒定分值，分值越高匹配度越好，結(jié)果越可信。本研究用質(zhì)譜儀對(duì)臨床分離的14個(gè)種的227株酵母真菌進(jìn)行鑒定，按照質(zhì)譜評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，鑒定分值達(dá)到種水平（評(píng)分＞2.0）的為90.31%（205/227），達(dá)到屬水平（評(píng)分＞1.7）為98.68%（224/227），與國內(nèi)外報(bào)道基本一致[2，14-15]。絲狀真菌鑒定評(píng)分達(dá)到種水平的為74.00%（74/100），達(dá)到屬水平為94.00%（94/100）。由此可見，質(zhì)譜儀在鑒定酵母菌上優(yōu)勢(shì)更突出。經(jīng)過與傳統(tǒng)鑒定方法的結(jié)果比對(duì)以及分子生物學(xué)方法對(duì)結(jié)果的確認(rèn)，我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜鑒定評(píng)分＞1.7的結(jié)果，作為臨床真菌種水平的診斷準(zhǔn)確性也較高，在今后的研究中將繼續(xù)評(píng)價(jià)。目前質(zhì)譜MALDIBiotyper 3.0系統(tǒng)中有178種酵母樣真菌的圖譜，但仍缺少個(gè)別種類，如本研究中鑒定錯(cuò)誤的奧默柯達(dá)菌。國外有研究生物梅里埃的Vitek MS系統(tǒng)，對(duì)奧默柯達(dá)菌的鑒定正確率為90.9%[16]，可見質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的完善程度直接影響其鑒定能力。有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)質(zhì)譜儀對(duì)以下絲狀真菌鑒定效果較好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉和毛霉目[12]，特別是臨床常見的曲霉菌。本研究中曲霉菌的鑒定正確率達(dá)到96.74%（89/ 92），與國外報(bào)道相似[6]，可替代臨床實(shí)驗(yàn)室曲霉菌的傳統(tǒng)鑒定方法。絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫圖譜較少，這為實(shí)驗(yàn)室提供了更大的拓展空間，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的特點(diǎn)，建立個(gè)性化的數(shù)據(jù)庫，提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。

隨著真菌研究的深入，發(fā)現(xiàn)真菌表型分類存在局限性，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)從遺傳和進(jìn)化角度進(jìn)行分類是目前真菌分類的方向[4]。例如近平滑假絲酵母菌通過基因分型可分為近平滑假絲酵母菌、似平滑假絲酵母菌和擬平滑假絲酵母菌3組，而且三者之間對(duì)藥物的敏感性存在差異，特別是棘白菌素抗真菌藥[17-18]。這表明物種鑒定可能對(duì)治療產(chǎn)生影響。本研究中對(duì)2株似平滑假絲酵母菌和1株擬平滑假絲酵母菌，質(zhì)譜儀都進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定，而VITEK-2未鑒定出結(jié)果。Quiles-Melero等[19]對(duì)77株臨床分離的近平滑假絲酵母菌復(fù)合群進(jìn)行了質(zhì)譜分型，并用分子生物學(xué)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，符合率為100%，提示通過質(zhì)譜儀可以對(duì)近平滑假絲酵母菌復(fù)合群進(jìn)行準(zhǔn)確的種內(nèi)分型，以便更好地指導(dǎo)臨床用藥。

本研究通過對(duì)現(xiàn)有各種真菌鑒定方法用時(shí)的比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜儀單株真菌鑒定用時(shí)僅需20min，并且可同時(shí)檢測(cè)多株菌，是目前用時(shí)最短、操作也較簡(jiǎn)便的方法，實(shí)驗(yàn)室人員經(jīng)過培訓(xùn)都可獨(dú)立操作，人為誤差較小。布魯克公司雖然已有檢測(cè)陽性血培養(yǎng)的成品試劑盒Bruker Sepsistyper問世，但價(jià)格較高，標(biāo)本只局限于血培養(yǎng)。國外有報(bào)道稱不能直接從體液中直接檢測(cè)真菌，必須通過前期的分離培養(yǎng)[20]。本研究初步發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)瓶中真菌只要為單一種類，質(zhì)譜鑒定可以得到滿意的結(jié)果。此方法可將體液真菌感染的鑒定時(shí)間提前24 h，為臨床治療爭(zhēng)取了時(shí)間。

質(zhì)譜儀在鑒定真菌的種屬水平上都達(dá)到了滿意的結(jié)果，尤其鑒定酵母樣菌和曲霉菌的能力更為突出，大大縮短臨床微生物鑒定的時(shí)間，且滿足真菌檢測(cè)的需求，可作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)真菌的常規(guī)方法。

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（2015-05-15收稿 2015-06-23修回）

（責(zé)任編委 辛紹杰 本文編輯 陳玉琪）

Application and evaluation ofmass spectrometry in identification of fungal infection

WANG Huan,JIA Tian-ye,BAO Chun-mei,ZHANG Cheng-long,ZHANG Ju-Ling,CUIEn-bo, CHEN Su-ming,XU dong-ping*,QU Fen*
Postgraduate Squad,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100036,China
*Corresponding author.XU dong-ping,E-mail:xudongping302@sina.com;QU Fen,E-mail:qf302@163.com

Objective To investigate the application ofmass spectrometry to the fungal infection,and to evaluate its ability to identify fungal infection.M ethods Totally 327 strains of fungi isolated from the inpatients admitted to our hospitalwere selected,and identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry(MALDI-TOFMS).The resultswere then compared with those of the identification by VITEK-2(yeast-like fungi)andmicroscope(filamentous fungi).Molecular biologymethods were used to confirm the identification.Results The results of the identification by MALDI-TOFMSshowed that identification rate of yeast-like fungiatspecies level(score>2.0)was90.31%,and thatat the genus level(score>1.7)was98.68%;identification rate of filamentous fungiatspecies levelwas 74.00%,and thatat the genus levelwas 94.00%.The accuracy of identification of Aspergillus could reach 96.74%.Conclusions Fungalspecies can bewell identified byMALDI-TOFMS,especially yeastsand Aspergillus.The identification by MALDI-TOFMScan be used as routine detectionmethod for clinical laboratory.

spectrometry,mass,matrix-assisted laserdesorption-ionization;fungi;infection

R379

A

1007-8134(2015)04-0210-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.04.006

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)基金（2011-4001-9）

100036北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究生隊(duì)（王歡）；100039北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（王歡、賈天野、鮑春梅、張成龍、張鞠玲、崔恩博、陳素明、曲芬），肝衰竭診療與研究中心（徐東平）

徐東平，E-mail:xudongping302@sina.com；曲芬，E-mail: qf302@163.com