南海紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium solani 387#次級代謝產(chǎn)物研究*

宋 雙，薛艷鈺，陸勇軍，李 靜，廖寶林，劉 嵐

(1.中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東廣州510275;2.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州510275;3.中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州510275;4.廣東省徐聞珊瑚礁國家級自然保護區(qū)管理局，廣東湛江524100)

紅樹林作為自然生長在熱帶、亞熱帶河口潮間帶的一種特殊木本植物群落，一直處于頻繁的潮汐、高鹽、強風(fēng)、強紫外輻射和缺氧的污泥特殊環(huán)境中［1］，為寄生在植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌提供了獨特的生活環(huán)境，使其能夠產(chǎn)生類型多樣、結(jié)構(gòu)新穎，且具有抗氧化、抗腫瘤、細胞毒等不同生理活性的次級代謝產(chǎn)物。對紅樹林內(nèi)生真菌生物活性物質(zhì)的研究已成為海洋微生物資源開發(fā)利用、尋找天然藥物先導(dǎo)化合物的重要途徑。

Fusarium solani 387#為深圳紅樹林植物白骨壤(Avicennia marina)內(nèi)生真菌，經(jīng)指紋圖譜及薄層色譜法分析，發(fā)現(xiàn)Fusarium solani 387#的次級代謝產(chǎn)物非常豐富。對該菌株大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)后采用正相柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、高效液相色譜等多種色譜分離手段，綜合運用現(xiàn)代波譜技術(shù) (MS、NMR、XRD等)以及用文獻數(shù)據(jù)比對的方法，從Fusarium solani 387#靜置培養(yǎng)的大米培養(yǎng)基中分離并鑒定了9個鐮紅菌素類化合物 (圖1):5(R)-deoxyfusarubin(1)、5(S)-deoxyfusarubin(2)、3-methyl ether fusarubin(3)、Fusarubin(4)、Anhydrofusarabin(5)、Anhydro-5-deoxyfusarubin(6)、2-acetonyl-3-methyl-7-methoxy-naphthazarin(7)、javanicin(8)、2-acetonyl-3-methyl-5-hydrogen-7-methoxy-naphthazarin(9)，其中化合物1和2的絕對構(gòu)型為首次報道。

圖1 化合物1，2，3，4，5，6，7，8，9結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of compounds 1，2，3，4，5，6，7，8，9

1 儀器與材料

Bruker AVANCE 600 MHz/500 MHz/400 MHz核磁共振波譜儀 (德國Bruker公司);LC1620型高效液相色譜儀 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);Oxford Diffraction Xcalibur Nova晶體衍射儀;MAT95XP型高分辨質(zhì)譜儀 (美國Thermo公司);ZAB-HS型雙聚焦磁質(zhì)譜儀 (FAB，英國 VG公司);Schmidt-Haensch，Polaptronic HNQW5型旋光儀 (日本島津公司)。薄層色譜硅膠GF254和柱色譜用硅膠 (青島海洋化工廠有限公司);Sephadex LH-20凝膠 (GE healthcare);高效液相色譜柱:Ultimate XB-C18制備柱 (21.2 mm×250 mm，5 μm，Welch公司);常規(guī)試劑均為分析純。

紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium solani 387#菌種從深圳市福田區(qū)紅樹林保護區(qū)的白骨壤中分離得到，由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陸勇軍教授提供并鑒定為腐皮鐮刀菌，保存于中山大學(xué)海洋學(xué)院海洋天然產(chǎn)物研究室。

2 提取與分離

菌種用大米培養(yǎng)基 (500 mL三角燒瓶64瓶，每瓶含大米80 g，w=3%人工海水100 mL)靜置培養(yǎng)30 d后，甲醇浸泡3次，減壓濃縮水相再用乙酸乙酯萃取3次，合并甲醇相和乙酸乙酯相減壓濃縮得到總浸膏63 g。以石油醚、乙酸乙酯、甲醇為洗脫劑用快速柱色譜進行極性分段，得石油醚相(15 g)、乙酸乙酯相 (28 g)和甲醇相 (20 g)。乙酸乙酯相用石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫 (V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)為100∶0→0∶100)，得到5個組分Fr.A～F，F(xiàn)r.B經(jīng)過硅膠柱色譜、Sephadex LH 20和半制備HPLC分離得到化合物5(20了mg)、6(5 mg)和化合物9(5 mg)。Fr.C和Fr.E經(jīng)酸處理硅膠柱色譜，用石油醚－乙酸乙酯洗脫，得到化合物3(20 mg)、化合物7(2 mg)和化合物4(30 mg)。Fr.D經(jīng)過硅膠柱色譜和半制備HPLC分離得到化合物8(5 mg)、1和2(4 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1和2:橙黃色晶體，ESI-MS m/z:289.1(［M-H］－，［2M+Na］+m/z:601.6)。結(jié)合1H NMR、13C NMR確定該化合物的分子式為C15H14O6，不飽和度為9。1H NMR表明分子結(jié)構(gòu)中含有一個酚羥基 (δH12.16，s)，兩個苯環(huán)上的間位氫原子 (δH7.1，d，2.4Hz;δH6.7，d，2.4 Hz)，一個甲氧基 (δH3.97，s)，兩個亞甲基 (δH4.62，m;2.48～2.74，m)，1個甲基 (δH1.54，s)，共14個H。ESI-MS只顯示一個分子離子峰，而通過13C NMR能看到譜圖中有化學(xué)位移及強度非常接近的9對碳信號峰，推測化合物1和2為一對對映異構(gòu)體，根據(jù)HMBC信息能確定氫分別歸屬于對應(yīng)的一對碳 (見表1)。

嘗試?yán)w維素衍生化手性色譜柱對1，2混合物進行拆分未成功，因化合物量僅4 mg，對化合物1，2混合物進行單晶培養(yǎng)，獲得單晶，以驗證是否為一對對映體。選擇丙酮為溶劑，用溶劑揮發(fā)法對化合物1，2的混合物進行單晶培養(yǎng)，順利得到了單晶，通過X－射線單晶衍射，確證單晶為一對對映體形成的混晶。并進一步確定化合物1和2分別為5(R)-deoxyfusarubin和5(S)-deoxyfusarubin，首次確定了5(R)-deoxyfusarubin和 (S)-deoxyfusarubin的絕對構(gòu)型，晶體結(jié)構(gòu)見圖 2。Devys 等［2］從 Fusarium solani Nectria haematococca中首次分離得到了5-deoxyfusarubin，但未報道化合物構(gòu)型。

化合物3:紅色粉末狀固體，ESI－MS m/z:319［M－H］－;結(jié)合1H NMR、13C NMR 可知其分子式 為 C16H16O7。1H NMR(500 Hz，CDCl3)δH12.93(1H，s)，12.65(1H，s)，6.15(1H，s)，4.86(1H，d，17.55 Hz)，4.55(1H，d，17.55 Hz)，3.9(3H，s)，3.3(3H，s)，3.0(1H，d，18.3 Hz)，2.66(1H，d，18.3 Hz)，1.58(3H，s);13C NMR(126 MHz，CDCl3)δ:184.6(C)，178.1(C)，160.9(OH－C)，160.7(C)，57.4(OH－C)，137.2(C)，132.9(C)，109.7(CH)，109.6(C)，107.6(C)，96.9(C)，58.7(CH2)，56.7(OCH3)，48.9(OCH3)，33.0(CH2)，22.8(CH3)。通過對比文獻［3］，確定該化合物為3－methyl ether fusarubin。

表1 化合物1和2的NMR數(shù)據(jù)1)Table 1 NMR chemical shifts and assignments of compound 1 and compound 2

圖2 化合物1和2的單晶結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Single crystal structures of compound 1 and compound 2

化合物4:紅色粉末狀固體，ESI－MS m/z:307.2［M－H］－，結(jié)合1H NMR、13C NMR可知其分子式為 C15H14O7。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δH2.97(1H ，s)，12.70(1H ，s)，6.22(1H ，s)，4.92(2H ，m)，3.97(3H ，s)，2.75(2H ，m)，1.68(3H ，s);13C NMR(126 MHz，CDCl3)δ:84.7(C)，178.2(C)，160.9(C)，160.7(C)，157.4(C)，137.2(C)，132.9(C)，109.7(CH)，109.7(C)，107.6(C)，94.3(C)，58.6(CH2)， 56.7(OCH3)， 32.2(CH2)， 29.4(CH3)。通過查閱文獻 ［4］，確定該化合物為Fusarubin。

化合物 5:紫色針狀晶體，ESI－MS m/z:287.2［M－H］－，結(jié)合1H NMR、13C NMR確定其分子式為 C15H12O6。1H NMR(500MHz，CDCl3)δH:13.04(1H，s)，12.65(1H，s)，6.17(1H，s)，5.99(1H，s)，5.21(2H，d，0.31 Hz)，3.92(3H，s)，2.01(3H，s);13C NMR(126 MHz，CDCl3)δC:183.0(C)，177.9(C)，161.7(C)，160.1(C)，158.1(OH－C)，158.1(OH－C)，133.2(C)，122.9(C)，111.1(C)，110.1(CH)，108.1(C)，94.9(CH)，63.1(O－CH2)，56.8(OCH3)，20.2(CH3)。通過與文獻［5］數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)化合物5與Anhydrofusarabin的光譜數(shù)據(jù)一致。

化合物6:深紅色針狀晶體，ESI－MS m/z:271.2［M－H］－，結(jié)合1H NMR、13C NMR確定該化合物的分子式為 C15H12O5，不飽和度為 10。1H NMR(500 MHz，Acetone－d6) δH:12.62(s，1H)，7.14(s，1H)，6.19(s，1H)，5.86(s，1H)，5.22(s，2H)，3.95(s，3H)，1.96(s，3H);13C NMR(126 MHz，Acetone) δ:191.4(C)，179.8(C)，162.3(C)，161.0(C)，157.0(C)，140.5(C)，132.2(C)，119.7(C)，114.2(CH)，113.2(C)，110.2(CH)，101.5(CH)，63.6(CH2)，57.3(OCH3)，19.9(CH3)。對比化合物6與化合物5的1H NMR信息，相對于化合物4而言化合物5少了一個酚羥基質(zhì)子 (δH13.4，s)信號峰，多了一個芳香質(zhì)子 (δH7.14，s)信號峰，結(jié)合分子式推測6可能比5少了一個酚羥基。進一步結(jié)合

13C NMR和HMBC確定了化合物5的結(jié)構(gòu)，通過比對文獻 ［6］數(shù)據(jù)，確定該化合物為4－deoxyhydanfusarubin。

化合物7:紅色針狀晶體，ESI－MS m/z:289［M－H］－，結(jié)合1H NMR、13C NMR可知其分子式為 C15H14O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3) δH:13.24(1H，s)，12.85(1H，s)，6.19(1H，s)，3.92(3H，s)，3.89(2H，s)，2.28(3H，s)，2.22(3H，s);13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ:204.1(C)，184.7(C)，178.1(C)，161.8(C)，161.0(C)，160.7(C)，142.9(C)，134.5(C)，110.1(C)，110.0(CH)，108.8(C)，57.1(OCH3)，41.6(CH2)，30.3(CH3)，13.2(CH3)。對照文獻 ［3］確定該化合物為2－acetonyl-3-methyl-7-methoxy-naphthazarin。

化合物 8:黃色針狀晶體，ESI－MS m/z:273.2［M－H］－，結(jié)合1H NMR、13C NMR確定其分子式為 C15H14O5。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δH:12.62(1H，s)，7.43(1H，s)，6.06(1H，s)，3.89(3H，s)，3.83(2H，s)，2.22(3H，s)，2.19(3H，s);13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ:203.8(C)，190.7(C)，179.4(C)，161.1(C)，159.9(C)，140.9(C)，135.1(C)，128.3(C)，121.5(CH)，112.4(C)，109.4(CH)，56.6(OCH3)， 49.2(CH2)， 29.8(CH3)， 12.1(CH3)。通過查閱文獻 ［7］，確定該化合物為5-hydroxy-3-methoxy-7-methyl-6-(2-oxopropyl)-1，4-naphthoquinone。

化合物9:黃色針狀晶體，ESI-MS m/z:273.2［M-H］－，結(jié)合1H NMR、13C NMR可知其分子式為C15H14O5。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δH:12.34(1H，s)，7.16(1H，d，2.5 Hz)，6.63(1H，d，2.5 Hz)，3.89(3H，s)，3.76(2H，m)，2.31(3H，s)，2.11(3H，d，0.6 Hz，);13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ:203.4(C)，188.2(C)，183.5(C)，166.1(C)，164.4(C)，146.4(C)，141.1(C)，109.8(C)，107.9(CH)，106.2(CH)，106.2(C)，56.1(OCH3)，41.8(CH2)，30.4(CH3)，12.9(CH3)。對照文獻 ［8］，確定該化合物為 2-acetonyl-3-methyl-5-hydrogen-7-methoxynaphthazarin。

4 結(jié)果與討論

旋光異構(gòu)體成對出現(xiàn)導(dǎo)致外消旋或部分外消旋化在天然產(chǎn)物中是一種有趣的現(xiàn)象。方偉等［9］和Nawong Boonnak等［10］從特境微生物－螳螂的共附生菌Daldinia eschscholzii及紅芽木屬植物根部粗提物的代謝產(chǎn)物中均發(fā)現(xiàn)了旋光異構(gòu)體成對出現(xiàn)導(dǎo)致外消旋或部分外消旋的現(xiàn)象，并對此進行了進一步的研究。鐮紅菌素類化合物是腐皮鐮孢菌次級代謝產(chǎn)生的典型化合物，此類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抑菌、細胞毒和抗癌活性等［11］。本課題組從紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium solani 387#的次級代謝產(chǎn)物乙酸乙酯相中分離得到了9個鐮紅菌素類化合物，利用核磁共振和單晶X衍射首次確定了化合物1和2的絕對構(gòu)型，并按照1∶1比例在該真菌中以外消旋體存在。

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