復方黃柏溫敏凝膠的制備和連翹苷含量測定

劉姍姍，王志君，劉繼勇，潘勇華，舒 薇，尤本明*

（1.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433；2.上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院藥材科，上海 200070）

復方黃柏溫敏凝膠的制備和連翹苷含量測定

劉姍姍1，王志君1，劉繼勇1，潘勇華1，舒 薇2，尤本明1*

（1.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433；2.上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院藥材科，上海 200070）

目的：篩選復方黃柏溫敏凝膠的最優(yōu)處方，建立測定其中連翹苷含量的HPLC法。方法：以泊洛沙姆407（P407）和泊洛沙姆188（P188）為基質(zhì)制備復方黃柏溫敏凝膠，通過相變溫度和黏度篩選最佳處方。HPLC法測定所用色譜柱：Hypersil ODS2-C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈:水（22:78），流速為1.0ml/min，檢測波長277nm，柱溫30℃。結(jié)果：最優(yōu)處方為P407:P188＝18:1作為基質(zhì)，相變溫度為27.17℃，黏度為15.31Pa·s。建立的HPLC法回收率、精密度和穩(wěn)定性良好，測得3批復方黃柏溫敏凝膠中連翹苷含量為（0.74±0.05）mg/g（n＝3）。結(jié)論：復方黃柏溫敏凝膠符合臨床應(yīng)用要求。建立的HPLC法準確、穩(wěn)定、專屬性強，可用于復方黃柏溫敏凝膠中的連翹苷含量測定。

復方黃柏溫敏凝膠；連翹苷；含量測定；色譜法，高效液相

［Pharm Care Res，2015，15（4）：269-272］

復方黃柏液由連翹、黃柏、金銀花、蒲公英和蜈蚣制成，具有清熱解毒、消腫止痛、祛腐生肌、抗菌消炎、促進傷口愈合的作用。該藥適用于骨髓炎、骨結(jié)核竇道、脈管炎等疑難病及瘡瘍潰后外傷感染等常見病，是化膿性感染、促進創(chuàng)面愈合的外用液體制劑［1，2］。復方黃柏液的缺點是藥效維持時間短，需用紗布濕敷［2］，使用不方便，而且容易造成傷口二次感染。普通凝膠劑涂抹不方便，尤其對于大面積及深度創(chuàng)面，無法保證涂抹均勻，且涂抹過程中容易損傷創(chuàng)面，不利于創(chuàng)面愈合，而溫敏凝膠能有效避免此類情況發(fā)生。溫敏凝膠是以溶液狀態(tài)給藥后，在用藥部位立即發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)化形成非化學交聯(lián)的半固體凝膠［3］。溫敏凝膠可通過皮膚、眼部、鼻腔、口腔、陰道、直腸等多種途徑給藥，黏附于給藥部位，延緩藥物釋放，有效提高生物利用度，是目前新型給藥系統(tǒng)的研究熱點之一，尤其適合做各種中藥提取物的給藥載體［4，5］。本研究以泊洛沙姆407（P407）和泊洛沙姆188（P188）為基質(zhì)，制備復方黃柏溫敏凝膠，并采用HPLC法測定其中連翹苷的含量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Gemini2流變儀（Bohlin Gemini公司）；LC-10ADVP高效液相色譜儀，包括LC-10AT泵、SPD-10A紫外檢測器、CTO-10A柱溫箱、CLASS VP色譜工作站和SCL-10Avp系統(tǒng)控制器（日本島津制作所）；FA-2004電子天平（上海精科天平儀器廠）；5804R型高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）。

1.2 試劑和藥品 P407和P188（德國BASF公司）；連翹苷對照品（含量95.3%，批號110821-201213，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；復方黃柏原液（批號1312121，山東漢方制藥有限公司）；蒸餾水（第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院制劑室自制）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溫敏凝膠的制備 用冷溶法制備復方黃柏溫敏凝膠［5］，在攪拌的條件下將處方量的P407和P188緩慢均勻地撒在水面上，然后置于4℃冰箱冷藏24h，使其充分溶脹，得到澄清、無團塊、分散均勻的凝膠溶液。在攪拌的條件下加入處方量的復方黃柏原液，即得復方黃柏溫敏凝膠。

2.2 流變學參數(shù)測定 采用Gemini2流變儀測定復方黃柏溫敏凝膠在32℃的黏度，并從15℃升溫至55℃確定相變溫度。升溫速度1℃/min，樣品溫度精確控制在±0.1℃內(nèi)，震蕩頻率0.5Hz，應(yīng)變幅度設(shè)定為1.0%，40mm錐板，間隙0.5mm。

2.3 處方的篩選 分別采用不同比例的P407（18%、19%、20%）和P188（2%、4%和6%）為基質(zhì)，按2.1項下方法制備空白凝膠和復方黃柏溫敏凝膠。測定不同處方制備的凝膠的相變溫度和黏度［3，5］，結(jié)果見表1。由表1可見，單獨使用P407作為基質(zhì)時，相變溫度呈現(xiàn)濃度依賴性，即P407濃度較高時相變溫度較低，反之相變溫度較高。固定P407的含量，少量P188可對相變溫度產(chǎn)生影響。隨著P188含量增加，相變溫度逐漸上升。固定P407和P188的含量，與空白凝膠相比，復方黃柏溫敏凝膠的相變溫度更低。綜合考慮相變溫度、黏度和人體表皮溫度，對P407含量為18%和19%的兩個體系做進一步處方優(yōu)化，見表2。

表2 精確優(yōu)化處方的相變溫度和黏度Table 2 Phase transition temperature and viscosity of the accurate optimized formula

預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，相變溫度為（27.5±0.5）℃的溫敏凝膠在常溫下為液態(tài)，而涂布到皮膚上呈凝膠狀。因此由表2可見，以P407:P188（18:1和19:2.5）為基質(zhì)制備的凝膠可滿足臨床治療需求，提高病人用藥依從性。進一步對比黏度曲線發(fā)現(xiàn)，P407:P188（18:1）處方的黏度曲線較為平緩，而P407:P188（19:2.5）處方的黏度隨著溫度升高逐漸升高（見圖1），不利于制劑質(zhì)量控制，因此最終確定以P407:P188（18:1）為最優(yōu)處方。按照最優(yōu)處方制備3批樣品，測定其相變溫度平均值為27.17℃，黏度平均值為15.31Pa·s。

2.4 連翹苷的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2-C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈:水（22:78），流速1.0ml/min，檢測波長277nm，柱溫30℃，進樣量20μl［6］。

圖1 復方黃柏溫敏凝膠的黏度曲線圖Figure 1 Viscosity curves of compound Phellodendron thermosensitive gel

2.4.2 溶液的配制 （1）對照品溶液：精密稱取10.0mg連翹苷對照品置100ml容量瓶中，用適量50%甲醇溶解并定容至刻度，得100μg/ml的連翹苷對照品母液。（2）供試品溶液：精密稱取1g復方黃柏溫敏凝膠置100ml容量瓶中，用適量50%甲醇稀釋，1.22×104×g離心5min。取1ml上清液置10ml容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，得供試品溶液。（3）陰性對照溶液：制備不含連翹的復方黃柏溫敏凝膠作為陰性對照品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液分別進樣測定，得到色譜圖見圖2。由圖2可見，處方中其他成分對連翹苷色譜峰無干擾。

圖2 連翹苷的HPLC譜圖Figure 2 HPLC photograms of forsythin

2.4.3 線性關(guān)系的考察 分別精密量取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml連翹苷對照品母液置100ml容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，得到系列濃度為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/ml的對照品溶液。按2.4.1項下色譜條件，測定峰面積（A）。以A對濃度（c）做線性回歸，得標準曲線方程A＝30 114c-186.86（r＝0.999 8，n＝6），表明連翹苷在0.2～2.0μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 回收率實驗 分別取適量已知濃度的供試品溶液與低、中、高濃度（0.4、0.8、1.2μg/ml）的對照品溶液混合搖勻，得到低、中、高濃度分別為0.57、0.77和0.97μg/ml的溶液。按2.4.1項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入標準曲線方程計算含量及回收率。得到低、中、高濃度連翹苷的回收率分別為（98.39±0.33）%、（98.57±0.45）%、（98.65±0.26）%（n＝3）。

2.4.5 精密度實驗 （1）日內(nèi)精密度：分別取低、中、高濃度（0.4、0.8和1.2μg/ml）的對照品溶液各20μl，按2.4.1項色譜條件，重復進樣3次，每次間隔時間4h，記錄峰面積，計算得到低、中、高濃度連翹苷的日內(nèi)RSD分別為1.67%、1.20%和0.39%（n＝3）。（2）日間精密度：取上述低、中、高濃度的對照品溶液，重復進樣3次，每次間隔時間24h，記錄峰面積，計算得到低、中、高濃度連翹苷的日間RSD分別為1.85%、0.29%和0.89%（n＝3）。

2.4.6 穩(wěn)定性實驗 將供試品溶液分別于配制后0、2、4、6和8h進樣測定，記錄峰面積，計算得到RSD＝0.73%（n＝5）。結(jié)果表明供試品溶液在配制后8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 樣品含量測定 取3個批號的復方黃柏溫敏凝膠各3份，按2.4.2項（2）方法制備供試品溶液，按2.4.1項色譜條件測定峰面積，計算濃度。3個批號的復方黃柏溫敏凝膠中連翹苷的平均含量為（0.74±0.05）mg/g（n＝3）。

3 討 論

與傳統(tǒng)的復方黃柏液相比，復方黃柏溫敏凝膠以液態(tài)形式給藥，在給藥部位可以迅速形成凝膠，不僅給藥方便，還可以起到緩釋作用，提高了復方黃柏液的生物利用度，更可以有效防止二次感染。復方黃柏液的制備過程中有一個冷凝沉淀后過濾的步驟，部分藥效成分會因為溶解度等原因大量損失，而溫敏凝膠制備過程中將復方黃柏原液直接加入，藥效成分充分保留，從而可以提高其有效成分含量。

對于相變溫度的測定，文獻報道多采用攪拌轉(zhuǎn)子法［7］和眼觀法［8］，但其主觀性太強，缺乏科學性。本研究使用流變儀直接測定黏度和相變溫度，結(jié)果更加客觀、可信?？瞻啄z加入復方黃柏原液后相變溫度有所降低，推測原因是由于處方中水含量降低，而P407含量增加。另外，復方黃柏原液中其他成分也有可能影響溫敏凝膠的相變溫度。

連翹是復方黃柏液的主要成方藥材之一，其中的連翹苷具有清熱、解毒、散結(jié)排膿等功效［1］。本研究采用HPLC法測定連翹苷含量，以乙腈-水（22:78）為流動相，成功使連翹苷和雜質(zhì)達到有效分離，并且保留時間較為合理。樣品提取時曾參考文獻［3］，但其所用的提取溶劑與溫敏凝膠基質(zhì)會發(fā)生反應(yīng)而凝固，改用50%甲醇作為提取劑未見此現(xiàn)象，且滿足含量測定方法學的要求，故最終以50%甲醇作為提取劑。本研究建立的HPLC法準確、穩(wěn)定、專屬性強，適用于測定復方黃柏溫敏凝膠中連翹苷的含量。

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Preparation and forsythin content determination of compound Phellodendron thermosensitive gel

LIU ShanShan1，WANG ZhiJun1，LIU JiYong1，PAN YongHua1，SHU Wei2，YOU BenMing1*
（1.Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；2.Department of Pharmacy，Central Hospital of Zhabei District of Shanghai，Shanghai 200070，China）

Objective：To screen the optimal formula of compound Phellodendron thermosensitive gel and establish a HPLC method for content determination of forsythin in it.Methods：Compound Phellodendron thermosensitive gel was prepared using poloxamer 407（P407）and poloxamer 188（P188）as matrix. The optimal formula was chosen according to the phase transition temperature and viscosity. The HPLC method was applied on a Hypersil ODS2-C18analytical column（150mm×4. 6mm，5μm），with the mobile phase consisting of acetonitrile-water（22:78）at a flow rate of 1. 0ml/min. Detection wavelength was 277nm and the column temperature was 30℃.Results：The optimal formula was using P407:P188（18:1）as matrix. The phase transition temperature was 27. 17℃and the viscosity was 15. 31Pa·s. Recovery，precision and stability of the HPLC method were all good. Content of forsythin determined in the three batches of compound Phellodendron thermosensitive gel were（0. 74±0. 05）mg/g（n＝3）.Conclusion：The compound Phellodendron thermosensitive gel conforms to the requirements of clinical application. The HPLC method is accurate，stable，specific and can be used for forsythin content determination of compound Phellodendron thermosensitive gel.

compound Phellodendron thermosensitive gel；forsythin；content determination；chromatography，high performance liquid

R944.9，R927.2 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0269-04

10.5428/pcar20150410

2015-05-29

］ 2015-07-16

上海市藥理學會皮膚藥理學專業(yè)委員會漢方中醫(yī)藥皮膚病學研究基金（201301），上海市衛(wèi)生局科研課題（20120481）

劉姍姍（女），藥師.E-mail：xuesong633@sina.com；王志君（女），主管藥師.E-mail：wl19521957@126.com；兩人為共同第一作者

尤本明，E-mail：bmyoush@126.com

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［本文編輯］ 蘭芬