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    萘降解菌的篩選及其對多環(huán)芳烴的降解

    2015-06-06 11:52:57王繼鋒
    石油化工 2015年1期
    關(guān)鍵詞:脫氫酶芳烴培養(yǎng)液

    高 闖,張 全,王繼鋒

    (1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院,遼寧 撫順 113001;2. 中國石化 撫順石油化工研究院,遼寧 撫順 113001)

    萘降解菌的篩選及其對多環(huán)芳烴的降解

    高 闖1,2,張 全2,王繼鋒2

    (1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院,遼寧 撫順 113001;2. 中國石化 撫順石油化工研究院,遼寧 撫順 113001)

    從柴油污染土壤中篩選分離出一株萘降解菌N-3,進(jìn)行了菌種鑒定及萘雙加氧酶基因(nah)驗(yàn)證,并考察了該菌對不同種類多環(huán)芳烴(PAHs)的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:該菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),含有nah基因;當(dāng)分別對液體培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為50 mg/L的萘、菲、蒽、芘、芴降解84 h時,菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%,34.83%,36.65%,27.50%,23.47%。菌株N-3的脫氫酶活性與其對不同PAHs的降解率呈一定的正相關(guān)性。該菌不僅能有效降解萘,且對其他種類PAHs也有一定降解作用。

    萘降解菌;多環(huán)芳烴;生物降解;菌種篩選;銅綠假單胞菌

    多環(huán)芳烴(PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)的芳香族化合物。近年來,隨著人類生產(chǎn)活動的加劇,使環(huán)境中的PAHs大量增加[1]。由于PAHs具有疏水性強(qiáng)、相對分子質(zhì)量高、穩(wěn)定性好、毒性大、難降解、在環(huán)境中存在時間長[2]、具有潛在致癌性等特點(diǎn)[3],被很多國家列為優(yōu)先控制污染物[4-5]。土壤中的PAHs主要來源于污水灌溉、大氣沉降和工業(yè)滲漏等。PAHs被土壤粒子吸附后,可經(jīng)農(nóng)作物富集而進(jìn)入食物鏈,威脅人類健康[6]。此外,土壤中的PAHs還可進(jìn)入大氣和水體,造成二次污染。目前,微生物法是降解PAHs最有效的方法之一[7-8]。該法通過微生物的生長代謝等過程將有毒、難降解的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成無毒無害的化合物,安全經(jīng)濟(jì)且對環(huán)境無二次污染。近年來已有多名學(xué)者分離篩選出不同種類的萘、菲、蒽、芘、芴等PAHs的降解菌[9-14]。

    本工作從柴油污染土壤中篩選、分離出一株高效萘降解菌N-3,對其進(jìn)行了菌種鑒定及PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),并考察了該菌株對單一萘、菲、蒽、芘、芴的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑、材料和儀器

    萘、菲、蒽、芘、芴、氯化三苯基四氮唑(TTC):純度均為99%,Sigma-Aldrich公司;正己烷:分析純;葡萄糖:純度為97%。

    Tris-HCl 緩沖溶液:三羥甲基氨基甲烷濃度為0.05 mol/L,pH=7.19。

    土樣:取自某市的柴油污染土壤。

    LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,NaCl 10.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH=7.0,121 ℃滅菌15 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    無機(jī)鹽培養(yǎng)基:KH2PO41.0 g,K2HPO41.0 g,NH4NO31.0 g,MgSO40.5 g,CaCl20.01 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g,蒸餾水1 000 mL,pH=7.0,121 ℃滅菌15 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    萘選擇性培養(yǎng)基及PAHs降解培養(yǎng)基:分別用正己烷配制萘、菲、蒽、芘、芴質(zhì)量濃度為1 g/L的有機(jī)溶液,過濾除菌,取一定量添加到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,使萘、菲、蒽、芘、芴的質(zhì)量濃度分別為50 mg/L,待正己烷揮發(fā)完畢后備用。

    在上述培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂,即得相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

    6010型紫外-可見分光光度計(jì):惠普公司;GC-2010型氣相色譜儀:日本島津公司。GTR21-1型離心機(jī):北京時代北利公司。

    1.2 萘降解菌的篩選

    取10 g柴油污染土壤加入到100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下浸取4 h,將浸取液在3 000 r/min下離心5 min,將10 mL上清液加入到100 mL萘選擇性液體培養(yǎng)基中經(jīng)4代富集培養(yǎng)(萘質(zhì)量濃度從50 mg/L逐步提高到200 mg/ L)后,取適量富集培養(yǎng)液,稀釋涂布在萘選擇性固體培養(yǎng)基平板上,待有明顯菌落出現(xiàn)時從中選取大小、形態(tài)各異的菌落在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步劃線純化分離。

    將各純化后的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中,于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)20 h,培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速6 000 r/min下離心,用生理鹽水重懸浮并調(diào)節(jié)菌懸液在600 nm處的吸光度(OD600)為1,冷藏備用。

    將各菌懸液按10%(φ)的接種量分別接種到萘選擇性液體培養(yǎng)基中,觀察其生長情況并測定培養(yǎng)液中的萘含量,實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行試樣。

    1.3 萘降解菌的鑒定

    利用Baldwin等[15]2003年報(bào)道的nah基因的簡并引物nahf/nahr,對篩選出的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),用細(xì)菌DNA提取試劑盒(Tiangen)對菌株進(jìn)行DNA提取。選擇一株生長情況最好、對萘降解能力最強(qiáng)且含有nah基因的菌株作為萘降解菌。

    菌株的鑒定工作委托中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。

    1.4 萘、菲、蒽、芘、芴的降解

    將萘降解菌的菌懸液按10%(φ)的接種量分別接種于100 mL 含不同PAHs的降解培養(yǎng)基中,于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng),定時取樣,測定菌體生長曲線及降解后培養(yǎng)液中各PAHs含量,實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行試樣。

    1.5 分析方法

    1.5.1 菌體濃度的測定

    以菌體培養(yǎng)液的OD600值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度。

    1.5.2 萘、菲、蒽、芘、芴質(zhì)量濃度的測定

    試樣經(jīng)正己烷萃取后,用氣相色譜儀測定各PAHs的質(zhì)量濃度。色譜條件:進(jìn)樣口溫度300 ℃,檢測器溫度330 ℃,毛細(xì)管柱50 m×0.25 mm×0.25 μm,柱溫130 ℃保持3 min,以15 ℃/min的升溫速率梯度升溫至280 ℃,進(jìn)樣量1 μL。

    1.5.3 脫氫酶活性的測定

    通過測定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對有機(jī)污染物的氧化分解能力,具體方法見文獻(xiàn)[16]:取2 mL降解后培養(yǎng)液于一系列具塞試管中,加入pH=8.5 的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液、0.1 mol/L 葡萄糖溶液、0.5%(w)TTC 各2 mL,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。加入2滴濃硫酸中止反應(yīng),并準(zhǔn)確加入5 mL甲苯,充分振蕩,萃取。待反應(yīng)生成的紅色三苯基甲臜(TF) 被完全萃取到有機(jī)相時,將有機(jī)相在4 000 r/min下離心5 min,過濾后測定濾液于486 nm處的吸光度(OD486),以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 萘降解菌的篩選

    經(jīng)過富集培養(yǎng),在萘選擇性固體培養(yǎng)基平板上得到3株能以萘為唯一碳源和能源生長的菌株,分別命名為N-1,N-2,N-3。3株菌在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長曲線見圖1,降解60 h后3株菌的萘降解率見圖2。由圖1和圖2可見,菌株N-3生長情況最好,且降解60 h后的萘降解率最高,達(dá)到25.31%。

    圖1 3株萘降解菌在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長曲線

    圖2 3株菌的萘降解率

    3株菌的nah基因擴(kuò)增電泳照片見圖3。由圖3可見,菌株N-1和N-3中均含有nah基因,而菌株N-2中未發(fā)現(xiàn)。結(jié)合圖1~3的結(jié)果,以下實(shí)驗(yàn)選擇N-3作為萘降解菌。

    圖3 3株菌的nah基因擴(kuò)增電泳照片M:分子標(biāo)記;NC:空白對照;N-1,N-2,N-3:萘降解菌

    2.2 菌株N-3的鑒定

    經(jīng)過對菌株N-3的16S rDNA序列分析,鑒定其為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。對該菌進(jìn)行簡單生理生化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:該菌為革蘭氏陰性菌,菌體的一端有單鞭毛,無芽胞;氧化酶陽性,能氧化分解葡萄糖和木糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,但不分解乳糖和蔗糖,可液化明膠,可分解尿素,可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)?,吲哚試?yàn)呈陰性,可利用枸櫞酸鹽,精氨酸雙水解酶陽性。

    2.3 菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解

    菌株N-3在不同PAHs體系中的生長曲線見圖4。由圖4可見:菌株N-3在萘、菲、蒽、芘、芴等5種PAHs中都能生長;在蒽和菲中生長情況最好,其次是萘,在芘和芴中生長情況最差。菌株N-3對不同PAHs的降解率見圖5。由圖5可見:經(jīng)過84 h的降解,菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%,34.83%,36.65%,27.50%,23.47%;菌株N-3對這5種PAHs降解能力的大小順序?yàn)椋狠欤痉疲据粒拒牛拒?,與該菌在不同PAHs體系中的生長情況呈一定的正相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該菌不僅可有效降解萘,而且也能有效降解液相中其他種類的PAHs。

    圖4 菌株N-3在不同PAHs體系中的生長曲線

    圖5 菌株N-3對不同PAHs的降解率

    2.4 菌株N-3的脫氫酶活性

    菌株N-3在不同PAHs體系中的脫氫酶活性見圖6。由圖6可見:菌株N-3在所有PAHs體系中的OD486都是先增大后減??;在菲和蒽體系中,菌株N-3的脫氫酶活性在前72 h上升迅速,而后略有下降;在萘、芘和芴體系中,菌株N-3的脫氫酶活性在前60 h上升迅速,而后呈下降趨勢,總體均低于菲和蒽體系中的脫氫酶活性。這表明該菌株對萘、芘和芴的降解能力沒有對菲和蒽的降解能力強(qiáng)。該結(jié)果與菌株N-3對不同PAHs降解率的結(jié)果呈正相關(guān)性,由此也可證明用脫氫酶活性表征微生物對有機(jī)污染物的降解能力是一種可靠的方法。

    圖6 菌株N-3在不同PAHs體系中的脫氫酶活性

    3 結(jié)論

    a)從柴油污染土壤中分離出一株降解萘的菌株N-3。該菌能以萘為唯一碳源及能源生長,經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),含有萘雙加氧酶基因nah。

    b)該菌能有效降解液相中的萘、菲、蒽、芘、芴。在質(zhì)量濃度為50 mg/L的不同種單一PAHs體系中,經(jīng)過84 h的降解,萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%,34.83%,36.65%,27.50%,23.47%。

    c)菌株N-3的脫氫酶活性與其對不同PAHs的降解率呈一定的正相關(guān)性,且對PAHs的降解具有廣譜性。

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    (編輯 葉晶菁)

    Screening of Naphthalene-Degrading Strain and Degradation of PAHs

    Gao Chuang1,2,Zhang Quan2,Wang Jifeng2
    ( 1. College of Petrochemical Engineering,Liaoning Shihua University,F(xiàn)ushun Liaoning 113001,China;2. Sinopec Fushun Petrochemical Research Institute,F(xiàn)ushun Liaoning 113001,China)

    A naphthalene-degrading strain N-3 was isolated and identified from the diesel-contaminated soil. The naphthalene dioxygenase(nah)gene in the cell was verified. The degradation abilities to different PAHs and the dehydrogenase activity of the strain were studied. The experimental results show that:N-3 is a Pseudomonas aeruginosa strain,containing nah gene;When naphthalene,phenanthrene,anthracene, pyrene or fluorene with 50 mg/L of mass concentration are degraded in the medium by N-3 for 84 h,their degradation rates are 28.81%,34.83%,36.65%,27.50% and 23.47%,respectively. There is a positive correlation between the dehydrogenase activity of N-3 and the degradation rates of different PAHs. The strain not only can degrade naphthalene effectively,but also can degrade other kinds of PAHs.

    naphthalene-degrading bacteriun;polycyclic aromatic hydrocarbons;bio-degradation;strain screening;Pseudomonas aeruginosa

    X172

    A

    1006 - 1878(2015)01 - 0017 - 04

    2014 - 07 - 23;

    2014 - 11 - 03。

    高闖(1987—),男,遼寧省撫順市人,碩士生,電話 18741390633,電郵 573088322@qq.com。聯(lián)系人:王繼鋒,電話 18941366706。

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