加味麻杏石甘湯對急性放射性肺炎大鼠Smad蛋白表達的干預(yù)作用

徐 佳林勝友

·論 著·

加味麻杏石甘湯對急性放射性肺炎大鼠Smad蛋白表達的干預(yù)作用

徐 佳1林勝友2

目的 明確加味麻杏石甘湯對大鼠急性放射性肺炎的干預(yù)作用，探討其作用機制。方法復(fù)制急性放射性肺炎SD大鼠模型，按高、中、低劑量組分別給予加味麻杏石甘湯灌胃，陰性對照組、模型組予生理鹽水灌胃，2mL/（220g·d），連續(xù)8周。各組分別于第2、4、8周隨機處死4只大鼠，取肺組織，采用Western Blot方法檢測大鼠肺組織P-Smad2、P-Smad3、Smad6、Smad7蛋白表達情況。結(jié)果 經(jīng)照射后，模型組P-Smad2、P-Smad3表達上調(diào)（P均＜0.01），各用藥組較模型組有不同程度下降（P均＜0.01）；模型組Smad6、Smad7表達下調(diào)（P＜0.01），各用藥組較模型組有不同程度上升（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 加味麻杏石甘湯能下調(diào)急性放射性肺炎模型大鼠肺組織P-Smad2、PSmad3蛋白表達，上調(diào)Smad6、Smad7蛋白表達。

大鼠；急性放射性肺炎；加味麻杏石甘湯；Smad蛋白

胸部腫瘤放療過程中，放射性肺炎發(fā)生率為5%～15%[1]，對肺功能有不同程度的影響。放射性肺損傷不僅限制放射治療的實施，也降低患者的放療效果和生存質(zhì)量，甚至影響患者生存期。目前，臨床多使用激素類、抗生素、抗氧化劑等藥物治療放射性肺炎，但療效有限，且不良反應(yīng)大，不宜長期使用。已有研究[2]證明，放射性肺損傷的發(fā)生和形成與TGF-β有密切關(guān)系，而Smad蛋白是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)過程中重要的細胞因子[3]。本研究擬通過建立急性放射性肺炎的動物模型，觀察放療后大鼠肺組織PSmad2/3、Smad6/7的表達水平，明確加味麻杏石甘湯對急性放射性肺炎的干預(yù)作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（220±20）g，上海西普爾-本凱試驗動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

1.2 藥品與試劑 以大鼠重220g每日灌胃量為2mL計算，相當于正常人體的20倍劑量，將麻杏石甘湯（炙麻黃9g，苦杏仁12g，生石膏18g，生草6g，金銀花9g等）加水濃煎至3g/mL。主要試劑：兔抗大鼠p-Smad2抗體（#3108，美國CST公司）、兔抗大鼠p-Smad3抗體（#9520，美國CST公司）、兔抗大鼠Smad6抗體（ab124890，美國Abcam公司）、兔抗大鼠Smad7抗體（ab13727，美國Abcam公司）、小鼠抗大鼠GAPDH抗體（Mab5465，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）、近紅外燃料標記的二抗（鼠抗、兔抗，美國Li-Cor公司）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，P0010S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、PVDF膜（0803LK，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀 器 多功能酶標儀（美國Thermo scientific公司Varioskan Flash and skanIt software）、小型垂直蛋白電泳儀（552BR021109，美國BIO-RAD公司）、紅外激光雙色成像系統(tǒng)（Odyssey CLx Infrared Imaging System，美國Li-Cor公司）、超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

2 實驗方法

2.1 急性放射性肺炎大鼠模型建立[4]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予編號，用隨機數(shù)字法取12只作為陰性對照組，不予處理。剩余48只大鼠，以如下方法進行造模：大鼠在未麻醉狀態(tài)下，腹部朝上，排列整齊，盡量使大鼠的肺部均位于一直線上，6只大鼠一架。用模擬定位機校準大鼠雙肺位置，用瑞士醫(yī)科達PreciseLINAC直線加速器（杭州市腫瘤醫(yī)院提供）進行單次全胸照射大鼠雙肺，用鉛塊屏蔽保護大鼠其余部分。照距SSD為100cm，總劑量20Gy。

2.2 分組與給藥 模型成功建立后，根據(jù)給藥劑量不同按隨機數(shù)字法分為麻杏石甘湯高、中、低劑量組和模型組，每組12只。麻杏石甘湯高、中、低劑量組分別給予相當生藥量為3、1.5、0.75g/mL的麻杏石甘湯灌胃（相當于正常成人體20、10、5倍劑量），2mL/（220g·d），連續(xù)8周。模型組和陰性對照組給予生理鹽水灌胃，2mL/（220g·d），連續(xù)8周。分別于第2、4、8周隨機各處死4只大鼠，取肺組織，保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

2.3 Western Blot法檢測肺組織P-Smad2/3、Smad6/ 7蛋白的表達 取大鼠肺組織，BCA法提取總蛋白并計算蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫避光孵育。再次洗膜后將PVDF膜正面朝下置于紅外激光雙色成像系統(tǒng)，經(jīng)Odyssey V3.0系統(tǒng)掃膜，成像于電腦。應(yīng)用該軟件測量條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，灰度比=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組P-Smad2表達比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對照組大鼠各時間段P-Smad2蛋白均維持在一較低水平；經(jīng)照射后模型組大鼠P-Smad2蛋白較陰性對照組表達升高，在第2周達到高峰（P＜0.01），第8周模型組較陰性對照組升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，各濃度麻杏石甘湯組第2周、第4周和第8周時均較模型組降低（P＜0.01），其中，麻杏石甘湯低劑量組第4周低于高、中劑量組（P＜0.01），第8周時低于高劑量組（P＜0.01），中劑量組第8周低于高劑量組（P＜0.01）。見圖1，表1。

圖1 各組各時間段P-Smad2蛋白表達的變化

表1 各組各時間段P-Smad2灰度值比較（±s）

表1 各組各時間段P-Smad2灰度值比較（±s）

注：與陰性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

陰性對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組33333 0.194±0.004 0.256±0.003##0.098±0.011** 0.106±0.007** 0.105±0.006** 0.037±0.003 0.052±0.003##0.034±0.003** 0.032±0.004** 0.017±0.002**△△▲▲0.038±0.002 0.041±0.003 0.021±0.003** 0.011±0.001**△△0.015±0.002**△△

3.2 各組P-Smad3表達比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對照組大鼠各時間段P-Smad3蛋白表達均維持在一較低水平；經(jīng)照射后模型組大鼠P-Smad3蛋白表達較陰性對照組升高，在第2周達到高峰（P＜0.01）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，高劑量組第2周、第8周低于模型組（P＜0.05），中、低劑量組各時間段均低于模型組（P＜0.01）；其中，中劑量組第2周、第4周、第8周均低于高劑量組（P＜0.01），第2周、第8周低于低劑量組（P＜0.05），高劑量組第2周低于低劑量組（P＜0.01），低劑量組第4周低于高、中劑量組（P＜0.01）。見圖2、表2。

圖2 各時間段各組P-Smad3蛋白的表達變化

表2 各組各時間段P-Smad3灰度值比較（±s）

表2 各組各時間段P-Smad3灰度值比較（±s）

注：與陰性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

陰性對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組33333 0.506±0.006 1.253±0.005##0.666±0.005** 0.536±0.004**△△0.919±0.007**△△▲▲0.865±0.005 1.041±0.013##1.033±0.017 0.792±0.006**△△0.587±0.031**△△▲0.041±0.004 0.056±0.003##0.048±0.005* 0.038±0.002**△△0.046±0.004**▲

3.3 各組Smad6表達比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對照組大鼠各時間段Smad6均維持在一較高水平；經(jīng)照射后模型組大鼠Smad6表達較陰性對照組下降，在第8周達到高峰（P＞0.05），第4周差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，高劑量組各時間段均較模型組升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中劑量組第8周高于模型組（P＜0.05），低劑量組第8周高于模型組（P＜0.01）；高劑量組第2周高于中劑量組（P＜0.01），中劑量組第8周高于高劑量組（P＜0.01），低劑量組第8周高于高劑量組（P＜0.01），第2周、第8周高于中劑量組（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 各時間段各組Smad6蛋白的表達變化

表3 各組各時間段Smad6灰度值比較（±s）

表3 各組各時間段Smad6灰度值比較（±s）

注：與陰性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別陰性對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)33333 2周1.677±0.194 1.613±0.247 1.677±0.23 1.052±0.303*△△1.712±0.097▲▲4周0.468±0.191 0.164±0.075##0.215±0.058 0.181±0.049 0.253±0.112 8周0.113±0.009 0.106±0.026 0.114±0.02 0.283±0.014**△△0.337±0.029**△△▲

3.4 各組Smad7表達比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對照組大鼠各時間段Smad7均維持在一較高水平；經(jīng)照射后模型組大鼠Smad7表達較陰性對照組下降，在第8周達到高峰，但各時間段差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.01）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，高劑量組第2周、第8周高于模型組（P＜0.01），中劑量組第2周、第8周高于模型組（P＜0.01），低劑量組第2周、第4周、第8周高于模型組（P＜0.05）；高劑量組第8周時高于低劑量組（P＜0.01），中劑量組第2周高于高劑量組、第8周高于低劑量組（P＜0.01），低劑量組第2周、第4周高于高劑量組（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 各時間段各組Smad7蛋白表達

4 討 論

放射性肺炎是指肺組織因大劑量放射性照射而引起的肺部急性炎性反應(yīng)，是胸部腫瘤放療最常見的并發(fā)癥[5]，骨髓疾病中也可見。肺組織對放射性非常敏感，極易出現(xiàn)急性損傷，通常在放療開始1～3個月后即出現(xiàn)，以發(fā)熱、干咳、痰中帶血、胸痛、憋悶等為主要臨床表現(xiàn)。

表4 各時間段各組Smad7灰度值比較（±s）

表4 各時間段各組Smad7灰度值比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別陰性對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)33333 2周4.586±0.287 3.674±0.626 5.565±1.170** 9.631±0.566**△△8.525±0.50**△△4周0.431±0.261 0.270±0.347 0.400±0.184 0.563±0.131 0.939±0.444**△8周0.107±0.003 0.038±0.004 0.108±0.014** 0.122±0.021** 0.063±0.004*△△▲▲

Smad蛋白家族是細胞內(nèi)重要的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，而放射性肺炎的形成發(fā)展與細胞因子TGF-β1最為密切相關(guān)[6-7]。TGF-β通路通過其他細胞因子將信號傳遞至下游Smad蛋白[8]，從而影響細胞核內(nèi)的基因表達。Smad蛋白家族包括受體調(diào)節(jié)型smad蛋白（Smad2、Smad3、Smad5、Smad8）、抑制型smad蛋白（Smad6、Smad7）和通用調(diào)節(jié)型Smad蛋白（Smad4）。Smad2、Smad3和（或）Smad4過度表達以及Smad6、Smad7被抑制可使TGF-β1持續(xù)激活。

麻杏石甘湯出自《傷寒論》，由麻黃、杏仁、石膏、炙甘草四味藥組成。配伍嚴謹，清宣降三法具備，針對放射性肺炎急性期熱毒攻伐、痰瘀互結(jié)之證，共奏清熱解毒、宣肺平喘之效。多個臨床研究[9-11]采用麻杏石甘湯為主的方劑治療早期放射性肺炎，均取得較好地療效。

本實驗采用20Gy全胸照射建立大鼠急性放射性肺損傷模型。課題組前期研究[12-13]已多次運用單次全胸20Gy照射大鼠雙肺成功復(fù)制放射性肺炎模型，且用HE染色病理組織學觀察肺組織情況與文獻[14-16]相符。

Smad2/3的磷酸化激活是TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路激活的最重要一步及標志，所以，P-smad2/3蛋白表達量即意味著TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路激活的程度[17]。本結(jié)果顯示，P-smad2/3經(jīng)照射后表達增強（P＜0.01）；加味麻杏石甘湯干預(yù)后，各加味麻杏石甘湯組p-smad2/3表達較模型組下調(diào)，其中加味麻杏石甘湯中劑量組起效時間較快，且效果持久。模型組Smad6/7表達較陰性對照組下降；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，各加味麻杏石甘湯組Smad6/7表達均有所上調(diào)，其中中劑量組對Smad7的干預(yù)中起效快且效果持久。

本實驗結(jié)果證實，p-smad2/3、Smad6/7作為細胞因子參與放射性肺損傷的發(fā)生過程。加味麻杏石甘湯干預(yù)以后，各時間段P-smad2/3蛋白表達有所下降，Smad6/7蛋白表達有所升高，其中中劑量組起效快且藥效持久，且與模型組相比大鼠整體情況有改善，證實加味麻杏石甘湯治療急性放射性肺損傷有效，其機制可能與干預(yù)Smad蛋白的表達有關(guān)。但放射性肺損傷的發(fā)生機制尚未完全明確。加味麻杏石甘湯治療放射性肺損傷的機制除了TGF-β/Smad通路以外是否尚存在其他信號通路等都值得進一步研究。

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（收稿：2015-06-06 修回：2015-08-13）

Intervention of Modified Maxing Shigan Decoction on Smad Protein Expression in Rats with Acute Radiation Pneumonitis

XU Jia1,LIN Shengyou2. 1 Department of Oncology,Xiaoshan First People's Hospital,Hangzhou (311200),China;2 Wushan Guoyiguan,Hangzhou Cancer Hospital,Hangzhou(311102),China

Objective To investigate the effect of modified Maxing Shigan decoction on rats with acute radiation pneumonitis and the underlying mechanism.Methods SD rat models of acute radiation pneumonitis were established.Rats were divided into modified Maxing Shigan decoction groups（high dose,middle dose,low dose）,control group,and model group.Modified Maxing Shigan decoction groups were intragastrically given 3,1.5,and 0.75g/mL（2mL/220g·d）of the corresponding drug for 8 weeks.Model group and control group were given equivalent volume of normal saline for the same period of time.Every 4 rats in each group were randomly sacrificed at 2,4,and 8 weeks to obtain lung tissue.The expressions of P-Smad2,P-Smad3,Smad6,and Smad7 proteins in lung tissue were analyzed by Western-blotting.Results After radiation,the expressions of P-Smad2 and P-Smad3 proteins in model group were up-regulated（P＜0.01）,while those in modified Maxing Shigan decoction groups were all downregulated（P＜0.01）.The expressions of Smad6 and Smad7 proteins in model group were down-regulated（P＜0.01）, while those in modified Maxing Shigan decoction groups were up-regulated（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Modified Maxing Shigan decoction can down-regulated the expressions of P-Smad2 and P-Smad3 proteins and up-regulated the expression of Smad6 and Smad7 proteins in lung tissue of rats with acute radiation pneumonitis.

rats;acute radiation pneumonitis;modified Maxing Shigan decoction;Smad protein

國家自然基金資助項目（No.81174246）

1杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科（杭州 311200）；2杭州市腫瘤醫(yī)院吳山國醫(yī)館（杭州 310002）

林勝友，Tel：13505715111；E-mail：linsy0628@163.com