負重爬梯與負重跑臺運動對大鼠股骨微結構及力學特性的影響

唐 量，高小航，趙新娟，張 靜，孫麗君

（陜西師范大學體育學院，陜西西安710119）

負重爬梯與負重跑臺運動對大鼠股骨微結構及力學特性的影響

唐 量，高小航，趙新娟，張 靜，孫麗君

（陜西師范大學體育學院，陜西西安710119）

觀察負重爬梯運動與負重跑臺運動對大鼠股骨微結構及生物力學的影響，分別評價兩種運動對股骨的作用效果。將28只16周SD雄性大鼠隨機分為3個組：負重跑臺運動組（WR），負重爬梯運動組（LC）以及對照組（CON）。WR組在晚上進行每周6次持續(xù)8周無坡度15m／min的負重跑臺運動，每組運動2min，間歇2min，共10組，周日休息；LC組在晚上同期進行負重爬梯訓練3組，每組10次，每次間歇2min；CON組不施加干預。實驗8周后，戊巴比妥鈉麻醉處死，并按解剖位置截取大鼠左右股骨分別用來進行Micro－CT掃描和三點彎曲實驗，對其微結構及生物力學參數(shù)進行分析。Micro－CT定量分析顯示，與CON組對比，WR組與CL組的骨小梁數(shù)量（Tb. N）和骨體積分數(shù)（BV／TV）均出現(xiàn)顯著性增加，骨小梁分離度（Tb.Sp）和結構模型指數(shù)（SMI）均呈現(xiàn)顯著性降低；三點實驗顯示，與WR組和CON組對比，CL組的彈性模量（MOE）呈現(xiàn)出顯著性增加；與CON組對比，WR組與CL組的最大載荷（ML）均出現(xiàn)顯著性增加，WR組的剛度出現(xiàn)顯著性增加。以上結果表明，經(jīng)過8周的負重訓練，兩種訓練方式均能在不同程度上改變骨的微結構及生物力學特性，負重爬梯訓練的效果優(yōu)于負重跑臺訓練。

負重跑臺；負重爬梯；骨微結構；力學特性；大鼠

年輕個體骨發(fā)育包括骨密度、骨小梁數(shù)量、骨體積等的日趨增加，眾多研究表明發(fā)育期進行運動干預是提高骨健康的最佳時期，對于骨健康的發(fā)育作用明顯［1－3］。青春期進行負重運動可以提高峰值骨量，青春期是峰值骨量的形成敏感時期，在生長發(fā)育的高峰期參加運動可以促進骨的構建，從而更好地預防如骨質疏松等骨組織相關疾病發(fā)生。

Micro－CT及三維重建技術近年來興起并廣泛用于對骨、胸腔器官、腹腔器官、血管結構的相關研究中［4］；三點彎曲實驗則是傳統(tǒng)的對實驗動物生物力學指標進行測試的一種手段［5］。本文采用 Micro－CT技術與三點彎曲實驗相結合的方式，對負重跑臺與負重爬梯兩種抗阻力運動后股骨的微結構與生物力學特性進行評價，為負重訓練促進骨組織健康提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

生理鹽水、紗布、游標卡尺、戊巴比妥鈉（pentobarbital sodium）、－80℃冰箱（V410，NBS）、課題組自行研發(fā)爬梯裝置、電動跑臺（杭州段氏）、材料測試系統(tǒng)（MTS－858，MTS System Inc.，USA）、Micro－CT掃描儀（ZKKS－MCT－Sharp，中國科學院自動化研究所分子影像研發(fā)中心聯(lián)合西安電子科技大學自主研發(fā)）。

1.2 實驗動物分組

28只健康成年Sprague－Dawley（SD）大鼠購自西安交通大學醫(yī)學院動物中心，適應性飼養(yǎng)后開始進行實驗，分籠飼養(yǎng)自由飲水進食，食物為國家標準嚙齒動物飼料（GB 14924.3－2001），室內溫度20～24℃，濕度40%～50%，飼養(yǎng)及運動期間動物無任何感染現(xiàn)象。

1.3 運動方案

SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為3個組：負重跑臺運動組（WR）10只、爬梯訓練組（LC）10只、正常對照組（CON）8只。為了防止運動組出現(xiàn)意外，負重飽合運動組與爬梯訓練組比對照組多出2只大鼠，最后取運動狀態(tài)較好的8只納入實驗。WR組在晚上進行每周6次持續(xù)8周無坡度15m／min的負重跑臺運動，負荷量為體重的35%，負重裝置采用自主專利產(chǎn)品［6］，每組運動2min，間歇2min，共10組，周日休息。LC組在晚上同期進行爬梯訓練3組，每組10次，按大鼠自身體重的35%采用尾部負重進行爬梯訓練［7］；爬梯高1m，每級梯階相隔2cm；訓練時爬梯傾斜85°放置；每次間歇2min。CON組不施加任何干預。

1.4 股骨樣品的處理

取材前動物禁食不禁水過夜，將SD大鼠用戊巴比妥鈉（50mg／kg）按體重麻醉后處死，立即取兩側股骨，剔除骨上附著的肌肉及軟骨組織，用生理鹽水浸過的紗布包裹保持骨樣品的濕潤放入－80℃保存待測。

1.5 生物力學參數(shù)的測定

1.5.1 股骨幾何參數(shù) 取得樣品后測量骨重，用游標卡尺分別測量股骨的骨長度、距股骨干骺端末端的矢狀徑、冠狀徑與股骨骨干中點的矢狀徑、冠狀徑的長度，并記錄備用。

1.5.2 三點彎曲實驗 股骨骨樣品在室溫融化，融化過程用生理鹽水保持骨的濕潤，融化后用材料測試系統(tǒng)進行骨樣品測試，將骨樣品置于支架上，調節(jié)跨距為20mm，其橫截面短軸的方向與載荷方向一致，以保證每個股樣品受力后沿長軸線產(chǎn)生的彎曲與加載后長軸產(chǎn)生的橈度方向一致。實驗速度設置為2mm／min。測試過程中，負荷力的變化與位移變化會自動記錄在電腦中，隨后，將數(shù)據(jù)導入OrininPro 9.0軟件（OriginalLab Corporation，USA）呈現(xiàn)負荷曲線及相關力學參數(shù)［8］，包括：最大載荷（Maximum Loading，ML）、斜率（Linear Slope，LS）、能量吸收（Energy Absorption Capacity，EAC）。在測試結束后于斷裂處用游標卡尺分別對股骨的骨截面外側長軸（a，mm）、骨截面外側短軸（b，mm）、股橫截面皮質骨的厚度（過四側皮質骨得出均值t，mm）進行測量并記錄。據(jù)公式求算出彈性模量（Modulus of Elasticity，MOE）：MOE＝FL3／48dI。其中，F(xiàn)為施與骨的載荷值（線性段），單位為N；d為載荷對應的位移，單位為mm；L跨距，單位為mm；I為慣性矩，據(jù)公式I＝π［ab3－（a－2t）（b－2t）3］／64計算。并用Origin9得出最大能量吸收（載荷－變形曲線下的面積，表示骨發(fā)生變形時吸收的總能量，單位為mJ）、剛度（線性部分斜率，單位為N／mm）。

1.6 Micro－CT

同樣，股骨樣品在室溫融化，融化過程用生理鹽水保持骨的濕潤，融化后用于Micro－CT掃描測試，將骨樣品固定于中間支架上，設置電壓為50kV，電流為1mA，角度增益為0.36°，曝光時間為250ms，分辨率為35μm×35μm×35μm進行掃描。掃描得到PRJ格式數(shù)據(jù)，將PRJ數(shù)據(jù)導入MedProject軟件進行坐標處理后得到IMO格式圖像，對IMO圖像進行三維重建。定量分析時，將IMO文件轉換為RAW格式導入3DMed軟件對感興趣區(qū)（Region of Interest，ROI）選取距生長板遠端10個片段（0.35mm）處60個片段（2.1mm）的區(qū)域進行分析，閾值分割（SegVolume，SG）為灰度值的峰值區(qū)域，對其進行可視化呈現(xiàn)，并分析如下物理參數(shù)：骨小梁數(shù)量（Tb.N），骨小梁分離度（Tb.Sp），骨小梁厚度（Tb.Th），骨礦物質密度（BMD），骨體積分數(shù)（BV／TV），結構模型指數(shù)（SMI）。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均以ˉx±SD表示，用PASW18.0（IBM，USA）軟件根據(jù)方差齊性進行單因素方差分析（One－Way，ANOVA）或LSD－t檢驗進行組間比較，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義的顯著性差異。

2 結果

2.1 三組大鼠體重及骨重比較

圖1顯示，經(jīng)過8周的負重跑臺運動與爬梯運動后，WR組與LC組與CON組對比，身體重量和股骨重量均沒有明顯差異。

圖1 三組大鼠的體重及骨重的比較Fig.1 Comparison of body weight and bone weight in three groups

2.2 三組大鼠Micro－CT定量分析

如圖2中Micro－CT定量分析結果顯示，經(jīng)過8周訓練，與CON組的大鼠相比，WR組左股骨的BV／TV與Tb.N均顯著性升高（+9.2%，P＝0.029；+7.7%，P＝0.037），LC組左股骨的BV／TV與Tb.N也顯著性升高（+8.8%，P＝0.025；+10%，P＝0.007）；WR組左股骨的Tb.Sp與SMI均顯著性降低（－18%，P＝0.016；－34.6%，P＝0.009），LC組左股骨的Tb.Sp與SMI也顯著性降低（－19.1%，P＝0.011；－37%，P＝0.005）；WR組BMD比CON組顯著升高（+11.4%， P＝0.013），在WR組與LC組中，Tb.Th中均沒有顯著性差異（見圖2b和d）。Micro CT的三維可視化圖像（圖3）進一步驗證了統(tǒng)計分析的結果，WR組及LC組在骨微結構上均優(yōu)于對照組。

圖2 三組大鼠左股骨的Micro－CT分析結果Fig.2 Results of Micro－CT analysis in left femur of rats in three groups

圖3 三組大鼠ROI區(qū)域的三維可視化圖像Fig.3 Three－dimensional visualization of the region of interest（ROI）in three groups

2.3 三組大鼠三點彎曲測試結果比較

由圖4顯示，經(jīng)過8周訓練，與CON組對比，WR組的ML顯著升高（+12.7%，P＝0.034），剛度顯著性升高（+23.4%，P＝0.028），MOE及EAC均沒有顯著性差異；CL組中，與CON組對比，MOE及ML均顯著性升高（+50.4%，P＝0.007；+14.1%，P＝0.024），EAC及剛度均沒觀察到顯著性差異；CL組與WR組對比，MOE顯著性升高（+20.4%，P＝0.046）。

圖4 三組大鼠右股骨的三點彎曲實驗結果Fig.4 Results of three－point test in right femur of rats in three groups

3 討論

骨骼作為人體的重要支撐系統(tǒng)，骨組織微結構出現(xiàn)惡化，會增加骨折風險［9］。其中一個有效的防御措施就是在青年期提高骨量，增進骨組織健康［1011］。負重運動作為常用運動方式的一種，除了對機體的各種機能產(chǎn)生影響外，還對機體骨骼肌的重量、體積、密度、力量的增加具有積極意義，從而對機體骨質疏松的預防、骨組織健康的促進發(fā)揮重要作用。有研究表明，規(guī)律的負重訓練是增進青少年骨組織健康的一種有效途徑［11－12］。早在1989年Feldkamp等［13］就提出Micro－CT這種基于X射線顯微成像系統(tǒng)用來分析骨結構可以精確到微米級，Micro－CT與傳統(tǒng)的骨組織形態(tài)計量學方法相比（先使用組織學方法制作組織切片，進而獲得局部的二維圖像，再計算出相關數(shù)據(jù)），具有操作簡便、無創(chuàng)性、適用范圍廣、數(shù)據(jù)精確、三維可視化、可重復性等優(yōu)點；隨后被廣泛用于分析骨組織的微結構，能夠真實反映骨組織的各種變化。又有學者指出在骨的微結構研究中至少要包括BV／TV、Tb.Th、Tb.Sp、和Tb.N這些基本指標［14］。三點彎曲實驗應用非常廣泛，相對于張拉、彎曲、壓縮和扭轉等測試方法具有操作簡便，數(shù)據(jù)準確，受其他因素干擾小的特點，但是卻不具有重復測試性。在實驗中，股骨通常用來作為研究對象，相對來講比較容易獲得三點彎曲實驗或四點彎曲實驗等來進行相關的力學特性。因此，本文通過使用Micro－CT系統(tǒng)與三點彎曲實驗相結合的方式對負重跑臺和負重爬梯運動后的大鼠進行股骨的微結構與力學特性的評價。

近年來，有多項研究提示，負重運動訓練對于提高骨量，減少骨折發(fā)生風險有積極的作用［15－17］，Hind和Burrows等［1］明確指出在青年期的負重訓練能促進骨的健康，而Rizzoli等［10］進一步指出青少年骨的健康成長可有效預防骨折的發(fā)生。本研究也顯示，經(jīng)過8周的負重訓練，股骨微結構的相關參數(shù)得到明顯改善，體現(xiàn)為骨小梁數(shù)量明顯增加，分離度明顯下降，骨體積分數(shù)明顯上升，SMI指數(shù)明顯下降。有研究指出骨小梁數(shù)目與骨的最大力量呈正相關［18］，本實驗中，我們也觀察到了8周負重運動后骨小梁數(shù)目與骨的最大力量均有顯著增加趨勢。有研究表明，經(jīng)過訓練大鼠與未經(jīng)過訓練的大鼠中骨體積分數(shù)明顯上升［19］，與本實驗的結果相一致。趙獻銀等［20］指出Tb.Sp的增大是導致骨量下降的主要誘因，經(jīng)過8周的負重訓練，無論是WR組或CL組隊Tb.Sp都有所下降，表明骨小梁排列更緊密，對于骨組織健康有積極意義。已經(jīng)有多位學者研究顯示，負重訓練會提高骨骼的BMD［1，21－23］，然而，也有學者指出雖然BMD的變化提供了骨骼變化的數(shù)量信息，但是BMD的變化只是顯示骨組織狀況的眾多因素之一，并不能客觀有效地反映骨強度的變化［24］。在我們的研究中，WR組的BMD顯著增加，沒有觀察到骨小梁厚度的差異性變化。Micro－CT的結果說明，負重跑臺與負重爬梯運動均在不同程度上改善了骨微結構，從而增進骨組織健康。

在對股骨力學特性的評估中，我們觀察到經(jīng)過8周負重跑臺運動的股骨剛度要顯著高于沒有經(jīng)過訓練的大鼠股骨剛度，而同期的負重爬梯組則沒有顯著性升高，提示我們8周負重跑臺運動對骨剛度的效果要好于負重爬梯訓練。Rubin［25］指出骨強度作為骨質健康的評價標準已經(jīng)得到越來越多的學者認可，它可以反映出骨的內在特性，與骨的幾何形狀無關。我們同樣觀測到，與CON組對比，WR組與LC組的ML均顯著增高，提示我們負重訓練能提高骨的最大載荷。在本次實驗中還觀察到，LC組的MOE顯著高于CON組與WT組，按照文獻［26］得出的理論，MOE對于骨組織健康程度的反映要優(yōu)于剛度與能量吸收。本研究結果顯示，8周負重爬梯運動在提高骨的力學特性方面優(yōu)于同期負重跑臺的運動效果，本次研究的力學特性與骨微結構的結果相符，進一步證明了力學特性與骨微結構之間有密切的相關性。

在本研究中，體重及骨重與正常組對比均未出現(xiàn)顯著性變化，說明負重運動并非通過增加重量的方式促進骨的健康，而是通過改變骨的微結構來改善骨的生物力學特征，促使骨組織對運動產(chǎn)生更好的適應性。據(jù)我們所知，鮮有學者對負重訓練后骨的微結構和力學特性做深入分析。因三點彎曲實驗具有不可重復的破壞性，所以在日常生活中有著致命的局限性，Micro－CT檢測也有不足之處，不能完全取代組織病理學與生物學檢測；但在骨骼的研究中，可以充分發(fā)揮Micro－CT在形態(tài)測量方面的優(yōu)勢。

4 結論

本文通過負重跑臺及負重爬梯兩種負重運動方式對大鼠股骨的影響進行了初步探索，用Micro－CT及三點彎曲測試對骨的微結構及力學特性進行綜合分析，得出兩種負重運動均可提高骨的質量而負重爬梯的效果稍優(yōu)于負重跑臺的訓練效果，體現(xiàn)在骨小梁數(shù)量明顯增加、分離度明顯下降、骨體積分數(shù)明顯上升、SMI指數(shù)明顯下降、骨的最大載荷量增加等方面。負重訓練在改善骨微結構，增強骨強度，改善骨負荷耐受能力，進而預防骨的相關疾病，增進骨的健康等方面具有積極意義，也為負重運動對骨的健康影響提供了可靠依據(jù)。

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〔責任編輯 李 博〕

The influence of weight－bearing treadmill running and climbing－ladder exercise on micro－structure and biomechanical properties of rats femur

TANG Liang，GAO Xiaohang，ZHAO Xinjuan，ZHANG Jing，SUN Lijun
（School of Physical Education，Shaanxi Normal University，Xi'an 710119，Shaanxi，China）

The aim of the study was to investigate the micro－structure and biomechanical properties of femur of rats that treated with weight－bearing treadmill running and climb ladder，and evaluating the meaning of two exercise to the femur.Twenty－eight male Sprague－Dawley rats were randomly divided into 3groups：weight－bearing treadmill group（WR），weight－bearing climbing ladder group（CL），control group（CON）.WR group were trained，running on a motor－driven treadmill at a speed of 15m／min（0incline）bearing with 35%their body－weight mass added，two minutes running and two minutes intervals between each 40minutes cycle，6days／week.LC group were trained three cycle（10times／cycle）with the same weight，two minutes intervals.After trained with 8weeks，all rats were euthanized by pentobarbital sodium and the femur were harvested for Micro－CT and three－point test.The results is revealed by Micro－CT.Comparing with the CON group，the trabecular number（Tb.N）and bone volume over total volume（BV／TV）of the WR group and CL group increased significantly.Meanwhile the trabecular separation（Tb.Sp）and structure model index（SMI）decreased significantly.The three－point test showed that，the Modulus of Elasticity（MOE）of the CL group were significantly higher than the WR group and CON group.The maximum loading（ML）of the WR group and CL group were significantly higher than the CON group.And the stiffness（slope linear）in the WR group increased significantly compared with the CON group.The results suggested that both ways of weightbearing training can improve the micro－structure and the biomechanical properties in different degrees after the 8weeks of weight－bearing training，and the weight－bearing climbing training is better than the weight－bearing treadmill training.

weight－bearing treadmill running；climbing－ladder exercise；bone micro－structure；biomechanical properties；rats

G804.6

：A

1672－4291（2015）06－0100－06

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.06.264

2015－06－20

國家自然科學基金（30900710）；陜西省自然科學基金（2015JQ2051）；中央高?；A科研項目（GK201402045）

唐量，男，教授，博士，研究方向為運動與慢性病的防治。E－mail：tl531＠snnu.edu.cn