解纖維素固氮芽孢桿菌與伴生菌的鑒定及其相互關(guān)系

熊 平，陶樹興，梁 健，馮曉磊，郭 賢，許真珍，唐 娜

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

解纖維素固氮芽孢桿菌與伴生菌的鑒定及其相互關(guān)系

熊 平，陶樹興＊，梁 健，馮曉磊，郭 賢，許真珍，唐 娜

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

通過提高加熱溫度和增加稀釋度分別獲得解纖維素固氮芽孢桿菌與伴生菌的純培養(yǎng)，依據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析對兩種菌進行鑒定；將兩種菌分別培養(yǎng)及二者按不同比例接種進行混合培養(yǎng)，測定活菌數(shù)量、纖維素酶活性和固氮量，探討兩種菌的相互關(guān)系。結(jié)果表明：解纖維素固氮芽孢桿菌AX32為栗樹類芽孢桿菌（Paenibacillus castaneae），伴生菌AX322為根癌土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）；混合培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)相比，兩種菌活菌數(shù)量降低，種間關(guān)系為競爭，但混合培養(yǎng)時纖維素酶活性和固氮量提高。

解纖維素固氮芽孢桿菌；伴生菌；菌種鑒定；相互關(guān)系

過量使用化肥對土壤環(huán)境和農(nóng)作物品質(zhì)的負(fù)面效應(yīng)已引起普遍關(guān)注；使用有機肥和微生物制劑來提高土壤肥力，實現(xiàn)土壤的可持續(xù)利用，已成為人們的共識［1］。目前，中國平原地區(qū)谷物收獲已廣泛采用機械化，在收獲的同時將秸稈粉碎還田不僅可以增加土壤有機質(zhì)含量也可以防止焚燒秸稈對環(huán)境的污染。分解纖維素的固氮芽孢桿菌能利用纖維素作為碳源和能源進行固氮和生長，更能適應(yīng)秸稈還田的土壤環(huán)境，與目前生產(chǎn)中使用的圓褐固氮菌（A－zotobacter chroococcum）相比，有芽孢的微生物制劑產(chǎn)品保存期更長［2－4］。本實驗室從不同地區(qū)不同作物的根際土壤分離到多株能利用纖維素的固氮芽孢桿菌，其中有些菌株在盆栽試驗中顯示與化肥對照效果相當(dāng)［4］。在篩選分解纖維素的固氮芽孢桿菌過程中，發(fā)現(xiàn)常有伴生菌生長，不容易得到純培養(yǎng)。王毓慶和羅國威曾對分離圓褐固氮菌出現(xiàn)的伴生菌小菌落進行了研究［5］，但解纖維素固氮芽孢桿菌與伴生菌的鑒定和相互關(guān)系還未見報道。在排除操作過程中的污染后，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)和菌落計數(shù)，發(fā)現(xiàn)伴生菌小菌落數(shù)量遠(yuǎn)多于固氮菌數(shù)量。經(jīng)不同溫度處理試驗，發(fā)現(xiàn)解纖維素固氮芽孢桿菌耐熱性高于伴生菌。提高加熱溫度獲得了解纖維素固氮芽孢桿菌的純培養(yǎng)，通過增加稀釋度獲得了伴生菌的純培養(yǎng)。本文報道解纖維素固氮芽孢桿菌AX32與伴生菌AX322的鑒定結(jié)果及兩個物種的相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

微晶纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基（g／L）：微晶纖維素（經(jīng)濕磨）10，硫酸鎂0.4，磷酸氫二鉀0.4，氯化鈉0.4，硫酸錳0.02，硫酸鈣0.4，硫酸亞鐵0.02，碳酸鈣5，1%鉬酸鈉溶液1mL／L，1%硼酸溶液1mL／L，pH值為7.2～7.4，121℃高壓蒸汽滅菌30min。固體培養(yǎng)基加瓊脂20g／L；纖維素剛果紅無氮平板培養(yǎng)基，在纖維素?zé)o氮固體培養(yǎng)基中加入剛果紅0.2 g／L。

1.2 土壤樣品

從陜西長安、三原、戶縣、銅川、勉縣、南鄭、洛川、延安，山西晉城、大同、交城，山東煙臺，湖北武漢等地，采集小麥、玉米、果樹、蔬菜等根際土壤樣品24份，用滅菌牛皮紙袋包裝，帶回后立即進行分離。

1.3 主要試劑和儀器

微晶纖維素購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，使用前置于有玻璃珠的三角瓶中，加無菌水，于168 r／min振蕩48h進行濕磨。剛果紅購于上海實驗試劑有限公司。

SPX－250B－D型恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS－IEA國華振蕩培養(yǎng)箱、HH－8B型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器公司；TGL－16G型高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU－1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FOSS－Kjeltec 2300全自動凱氏定氮儀：瑞典產(chǎn)品（上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司）。

1.4 解纖維素固氮芽孢桿菌與伴生菌的分離

將土壤懸液于加有玻璃珠的三角瓶中振蕩30 min，85℃加熱10min，10倍系列稀釋后涂布微晶纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)3d，選單菌落再做劃線分離于28℃培養(yǎng)3d，移接斜面培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)3d后置4℃保存。

1.5 解纖維素固氮芽孢桿菌與伴生菌的純化

將分離到的解纖維素固氮芽孢桿菌接入斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d，每支斜面用5mL無菌水洗下菌苔裝于有玻璃珠的無菌三角瓶中，168r／min振蕩20min得菌懸液。純化解纖維素固氮芽孢桿菌是將菌懸液分裝于無菌試管中，分別于80、85、90、95、100℃的水浴中加熱處理10min，用0.85%生理鹽水系列稀釋，取0.1mL菌液涂平板，每個稀釋度做3個重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，3d后觀察菌落生長情況，挑取單菌落移接斜面培養(yǎng)后，再進行液體培養(yǎng)和涂平板確定有無伴生菌存在。伴生菌的純化是菌懸液不經(jīng)加熱處理，直接用0.85%生理鹽水系列稀釋至10－9，取0.1mL菌液涂平板，每個稀釋度做三個重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，3d后觀察菌落生長情況，挑取伴生菌小菌落移接斜面培養(yǎng)后，再進行液體培養(yǎng)和涂平板確定有無解纖維素固氮芽孢桿菌存在。

1.6 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32及其伴生菌AX322的鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化測定 將已純化的解纖維素固氮芽孢桿菌AX32斜面接入微晶纖維素?zé)o氮液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d后，用0.85%生理鹽水梯度稀釋，取0.1mL菌液涂平板，28℃培養(yǎng)3 d后，觀察菌落形態(tài)。革蘭氏染色、莢膜染色、芽孢染色和生理生化特性、耐熱性、耐鹽性等試驗，按參考文獻［6］進行。1.6.2 16SrDNA序列和系統(tǒng)學(xué)分析 16SrDNA序列提取和測序由上海生工生物工程有限公司完成，基因比對采用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST和Genback在線完成，系統(tǒng)學(xué)分析采用MEGA4.1（Beta 3）軟件完成。

1.7 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32與伴生菌AX322的相互關(guān)系

1.7.1 生長量的測定 在經(jīng)活化的AX32與AX322的斜面中加入無菌水洗下菌體，置于有玻璃珠的三角瓶中于168r／min振蕩20min混勻。將AX32與AX322分別接種于50mL微晶纖維素?zé)o氮液體培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，同時按AX32∶AX322等于1∶1、3∶1、1∶3的比例分別接種于50 mL微晶纖維素?zé)o氮液體培養(yǎng)基中進行混合培養(yǎng)，接種量均為8%，接種后于28℃，168r／min振蕩培養(yǎng)3d，用平板菌落計數(shù)法測定生長情況。

1.7.2 纖維素酶活性測定 將1.7.1的培養(yǎng)物，于6 000r／min，離心15min，取上清液得到粗酶液。

以pH值為6.0磷酸緩沖液配制的1%微晶纖維素（經(jīng)濕磨）懸液和0.1%纖維二糖溶液為底物，按預(yù)試驗確定的最佳酶活測定條件（酶液稀釋6倍，水浴30℃，預(yù)熱10min，反應(yīng)25min）測定AX32與AX322及二者混合培養(yǎng)物所得粗酶液的纖維素酶活力。

1.7.3 固氮量測定 取1.7.1的培養(yǎng)物20mL，在凱氏燒瓶中蒸干，采用全自動凱氏定氮儀測定固氮量。

1.7.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件完成。

2 結(jié)果分析

2.1 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32與其伴生菌AX322的分離純化

從24份土壤樣品中共獲得解纖維素固氮芽孢桿菌67株，其中14株固氮量較高。液體培養(yǎng)后活菌計數(shù)時發(fā)現(xiàn)，這些菌株大多出現(xiàn)了兩種菌落，一種為光滑濕潤有莢膜直徑大于2mm的大菌落，另一種為直徑小于1mm的小菌落。對固氮量較高的解纖維素固氮芽孢桿菌AX32重復(fù)進行試驗，通過試驗排除了操作環(huán)境、操作過程和搖瓶紗布通氣塞造成污染的可能性，菌落數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)小菌落數(shù)量大約是大菌落數(shù)量的26倍。在后續(xù)實驗中，熱處理時間仍為10min，通過提高熱處理溫度（表1）淘汰了小菌落獲得了純化的大菌落菌株AX32，不提高熱處理溫度，通過增加稀釋度獲得了小菌落伴生菌AX322。

表1 熱處理溫度對AX32存活率的影響Tab.1 Effect of thermal treatment on survival rate of AX32

2.2 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32與其伴生小菌落AX322的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32在微晶纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形且透明有光澤，菌落直徑大于2mm，邊緣整齊，黏稠（圖1a）。菌體呈桿狀，寬0.79～1.3μm，長2.5～5.2μm，革蘭氏染色為陽性（圖1b）；菌體外有莢膜包被（圖1c）；培養(yǎng)3d后菌體內(nèi)形成芽孢，芽孢位于菌體中央，橢圓形，直徑不大于菌體寬度（圖1d）。

伴生菌AX322在微晶纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基平板上菌落突起，邊緣整齊光滑，透明無色，黏度?。▓D2a）。菌體單桿狀，寬0.6～0.9μm，長0.9～2.0 μm，革蘭氏染色為陰性（圖2b）；菌體外有微莢膜包被（圖2c）；不形成芽孢（圖2d）。

圖1 菌株AX32的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain AX32

圖2 AX322的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain AX322

2.2.2 生理生化特性 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32的生理生化實驗結(jié)果為：接觸酶反應(yīng)陽性，液化明膠，水解淀粉，石蕊牛奶反應(yīng)陽性，v－p反應(yīng)陰性，不產(chǎn)生吲哚，甲基紅試驗陰性，不利用檸檬酸鹽，不還原硝酸鹽，氧化酶反應(yīng)陰性；發(fā)酵D+葡萄糖、D+蔗糖、D+乳糖、D+半乳糖、D+果糖、甘露醇、D+麥芽糖和D+纖維二糖，不發(fā)酵D+核糖、L+阿拉伯糖和木糖。當(dāng)NaCl濃度＜1.50%時，可以生長；pH值為5.7不生長；溫度＞38℃時生長受到抑制。

伴生小菌落AX322的生理生化實驗結(jié)果為：接觸酶反應(yīng)陽性，3－酮基乳糖反應(yīng)為陰性，液化明膠，水解淀粉，石蕊牛奶反應(yīng)產(chǎn)堿，甲基紅試驗陰性，v－p反應(yīng)陰性，不產(chǎn)生吲哚。

2.2.3 16SrDNA序列分析 利用NCBI中的BLAST軟件分析菌株AX32 16SrDNA序列長度為1 511bp，伴生菌AX32216SrDNA的序列長度為1 378bp。菌株與Genbank數(shù)據(jù)庫不同菌株16SrDNA序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株AX32與Paenibacillus castaneae（登錄號：NR 044403.1）同源性達到99%，GC含量為54.93%。發(fā)現(xiàn)菌株AX322與Agrobacterium tumfaciens（登錄號：FR828334.1）同源性達到99%，GC含量達54.57%。采用MEGA4.1（Beta 3）軟件繪制AX32系統(tǒng)進化樹如圖3和AX322系統(tǒng)進化樹如圖4。依據(jù)解纖維素固氮芽孢桿菌AX32和伴生菌AX322的形態(tài)特征、生理生化特性和參考文獻［6－8］，解纖維素固氮芽孢桿菌AX32的鑒定結(jié)果為栗樹類芽孢桿菌Paenibacillus castaneae，伴生菌AX322為根癌土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）。

圖3 AX32系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of AX32

圖4 AX322系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AX322

2.3 解纖維素固氮芽孢桿菌AX32與伴生菌AX322的相互關(guān)系

表2是AX32和AX322純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)時生長量比較。由表2可見，兩株菌混合培養(yǎng)時的活菌數(shù)均比純培養(yǎng)時的活菌數(shù)明顯減少，說明AX32與AX322之間存在競爭關(guān)系。

表2 AX32和AX322的純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)生長量比較Tab.2 Comparison on growth of sole and mixed cultivation of AX32 and AX322

圖5和圖6是AX32和AX322純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)時纖維素酶活性的比較。由圖5可見，微晶纖維素酶活性，第1組（AX32純培養(yǎng)）高于第2組（AX322純培養(yǎng)），但差異不顯著。混合培養(yǎng)的第3組（AX32∶AX322＝1∶1）和第4組（AX32∶AX322＝3∶1）都高于第1組和第2組，差異顯著；混合培養(yǎng)的第5組（AX32∶ AX322＝1∶3）略高于第1組，差異不顯著；混合培養(yǎng)的第5組高于第2組，差異顯著。由圖6可見，β－葡萄糖苷酶活性，第1組略高于第2組，差異不顯著；第3、4、5組均高于第1組和第2組，差異顯著?？偟膩碚f，與純培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)時微晶纖維素酶活性和β－葡萄糖苷酶活性都有提高。

圖5 AX32和AX322純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)微晶纖維素酶活性比較Fig.5 Comparison on microcrystalline cellulase activity of sole and mixed cultivation of AX32 and AX322

圖6 AX32和AX322純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)β－葡萄糖苷酶活性比較Fig.6 Comparison onβ－glucosidase activity of sole and mixed cultivation of AX32 and AX322

圖7是AX32和AX322純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)時固氮量比較。由圖7可見，混合培養(yǎng)的第3、4、5組的固氮量略高于純培養(yǎng)第1組，差異不顯著，但明顯高于純培養(yǎng)第2組，差異顯著，說明AX32和AX322混合培養(yǎng)時固氮量高于單獨培養(yǎng)。

圖7 AX32和AX322純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)固氮量比較Fig.7 Comparison on nitrogen－fixing amount of sole and mixed cultivation of AX32 and AX322

3 討論

自生固氮菌分離培養(yǎng)時常伴生小菌落的現(xiàn)象早已發(fā)現(xiàn)［5］，一般的分離純化方法不易解決，解纖維素固氮芽孢桿菌及其與伴生菌的關(guān)系未見報道。本文依據(jù)固氮芽孢桿菌與土壤桿菌耐熱性的差異以及伴生菌數(shù)量占優(yōu)勢的特點，通過提高加熱溫度獲得了解纖維素固氮芽孢桿菌的純培養(yǎng)，增加稀釋度獲得了伴生菌的純培養(yǎng)。這對芽孢桿菌與非芽孢桿菌混合物的分離純化有普遍意義。

目前，固氮菌劑生產(chǎn)主要使用圓褐固氮菌，該菌不能利用纖維素，菌劑保存期也較短。類芽孢桿菌屬是有別于芽孢桿菌的新屬［9－10］，已有報道指出，某些類芽孢桿菌能夠利用幾丁質(zhì)和纖維素等不溶性多糖，還有些類芽胞桿菌可以產(chǎn)生固氮酶有固氮作用［4，1113］，解纖維素固氮芽孢桿菌可以利用纖維素作為碳源和能源進行固氮生長，且芽孢桿菌抗逆性強、菌劑保存期長。本實驗室曾報道了既能利用纖維素又能固氮的膠質(zhì)類芽孢桿菌CX21［4］，解纖維素固氮芽孢桿菌AX32鑒定結(jié)果屬于栗樹類芽孢桿菌，AX32的生長量、固氮效率、纖維素酶活性以及盆栽試驗中對黃瓜的促生長作用均高于CX21。解纖維素固氮芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)，豐富了類芽胞桿菌屬中利用纖維素和固氮芽孢桿菌的種類；另外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，隨著有機肥施用量的增加和谷物機械化收割秸稈還田的普及，解纖維素固氮芽孢桿菌更能適應(yīng)土壤環(huán)境，具有潛在開發(fā)利用價值。

通過鑒定，伴生小菌落屬于土壤桿菌屬中的根癌土壤農(nóng)桿菌。Anderson［14］曾報導(dǎo)在美國較多酸性和堿性土壤中有一種與固氮菌相伴生的小桿狀菌且有固氮作用，命名為Pseudomonas azotocolligans，但Pseudomonas azotocolligans能否以纖維素為唯一碳源尚未有報道。本實驗證實Agrobacterium tumefaciens AX322在微晶纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基上生長良好，這很可能就是它在土壤中可以大量存在的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)解纖維素固氮芽孢桿菌與其伴生菌混合培養(yǎng)時，互相競爭，導(dǎo)致菌數(shù)下降，這一結(jié)果與文獻中伴生菌在無氮培養(yǎng)基上對固氮菌生長有抑制作用的結(jié)論一致［15］。本實驗發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)與純培養(yǎng)相比，纖維素酶活力和固氮量略有提高，但考慮到農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的保質(zhì)期，在固氮菌劑生產(chǎn)時，還是采用解纖維素固氮芽孢桿菌純種培養(yǎng)為好。

4 結(jié)論

在篩選解纖維素固氮芽孢桿菌時常有小桿菌伴生，本研究通過提高加熱溫度和增加稀釋度分別獲得了解纖維素固氮芽孢桿菌AX32與伴生菌AX322的純培養(yǎng)；依據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析對兩種菌進行鑒定，解纖維素固氮芽孢桿菌AX32為栗樹類芽孢桿菌（Paenibacillus castaneae），伴生菌AX322為根癌土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）。將兩種菌分別培養(yǎng)及二者按不同比例接種進行混合培養(yǎng)，測定活菌數(shù)量、纖維素酶活性和固氮量，探討兩種菌的相互關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)相比，兩種菌的活菌數(shù)量降低，種間關(guān)系為競爭，但混合培養(yǎng)時纖維素酶活性和固氮量略有提高?？紤]到農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的保質(zhì)期，在固氮菌劑生產(chǎn)時，還是采用解纖維素固氮芽孢桿菌純種培養(yǎng)為好。

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〔責(zé)任編輯 王 勇〕

Identification and interrelation of cellulose degradation nitrogen－fixing bacillus and associated bacteria

XIONG Ping，TAO Shuxing＊，LIANG Jian，F(xiàn)ENG Xiaolei，GUO Xian，XU Zhenzhen，TANG Na
（School of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi'an 710119，Shaanxi，China）

By increasing temperature and dilution degrees，pure cultivation of cellulose degradation nitrogen－fixing bacillus and its associated strain were obtained.Based on morphological，physiological，biochemical characteristics and 16SrDNA sequence analysis，two strains have been identified.A sole cultivation and mixed cultivation in different ratios were conducted respectively.Interrelation between two strains was discussed by determining cell count，cellulase activity and nitrogen－fixing amount.The results indicated that cellulose degradation nitrogen－fixing bacillus AX32is Paenibacillus castaneae and its associated strain AX322is Agrobacterium tumefaciens.Compared to the sole cultivation，viable number of both strains in mixed cultivation decreased，which suggests a competitive interspecific relationship.But both the cellulase activity and nitrogen－fixing amount increased in mixed cultivation.

cellulose degradation nitrogen－fixing bacillus；associated fungus；strain identification；interrelation

Q939.96

：A

1672－4291（2015）06－0059－06

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.06.364

2015－02－10

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃（2011JM3003）

熊平，女，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)。E－mail：1933171373＠qq.com

＊通信作者：陶樹興，男，教授。E－mail：taoshx＠snnu.edu.cn