河豚魚皮膠原寡肽制備工藝的優(yōu)化

郭洪輝,洪 專,張怡評(píng),陳思謹(jǐn),李黃庭

(國(guó)家海洋局第三海洋研究所,國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361005)

河豚魚皮膠原寡肽制備工藝的優(yōu)化

郭洪輝,洪 專*,張怡評(píng),陳思謹(jǐn),李黃庭

(國(guó)家海洋局第三海洋研究所,國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361005)

研究以無毒河豚魚皮作為原料,采用兩步酶解法制備膠原寡肽的最佳工藝。以水解度和分子量為指標(biāo),通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,第一步最佳用酶為魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶或胰蛋白酶,第二步最佳用酶為酸性蛋白酶。酸性蛋白酶的最佳酶解條件為:投酶量2%,pH4.5,溫度50℃,水解時(shí)間8h。制備得到的河豚魚皮膠原寡肽分子量分布主要集中在100～600u。凍干樣品的膠原肽含量為94.0%,灰分為0.71%,水分為5.2%。

魚皮,膠原寡肽,水解度,正交實(shí)驗(yàn)

河豚魚(puffer fish),又名氣泡魚,味道鮮美卻又劇毒。野生河豚魚中含有的劇毒物質(zhì)河豚魚毒素,具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值[1]。上世紀(jì)90年代初,由于野生河豚產(chǎn)量劇減,遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需求,很多地方對(duì)其開展了人工養(yǎng)殖。經(jīng)過近20年的發(fā)展,我國(guó)養(yǎng)殖技術(shù)逐步成熟,養(yǎng)殖的河豚魚大多數(shù)已達(dá)到無毒級(jí),目前我國(guó)無毒河豚魚已成為國(guó)外河豚魚供給的主要來源。河豚魚的出口加工產(chǎn)生了大量的魚皮等下腳料,僅被用于生產(chǎn)高附加值的魚粉,造成了極大的資源浪費(fèi)[2-3]。因此,魚皮資源的深加工和高值化利用,不僅對(duì)水產(chǎn)品加工綜合利用有重要意義,而且也能支持和促進(jìn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的發(fā)展。

利用河豚魚皮為原料制備膠原和膠原蛋白肽已有研究[4],但未見以河豚魚皮為原料制備膠原寡肽的研究報(bào)道。膠原寡肽是由2～12個(gè)氨基酸組成的肽,分子量小于1000u[5],具有許多重要的生理功能如:抑制ACE[6-7]、提高免疫性等[8-9]、促進(jìn)皮膚膠原代謝[10]、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗腫瘤[11]等。本文以河豚魚皮作為原料,先用酸堿進(jìn)行預(yù)處理,再用兩步酶法制備魚皮膠原寡肽,利用單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件,為規(guī)?；a(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

lactic acid production by pellet-formRhizopusoryzaeR1021 in a stirred tank fermentor[J]. Chemical Engineering Science,2003,58(3-6):785 - 791.

[18]C D Skory. Lactic acid production byRhizopusoryzaetransformants with modified lactate dehydrogenase activity[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(2):237-242.

1.1 材料與儀器

河豚魚皮 購(gòu)于福建漳州水產(chǎn)品加工廠;Superdex peptide 10/300GL凝膠分析柱 美國(guó)GE公司;氫氧化鈉、鹽酸 廣州西隴化工有限公司;胃蛋白酶(4000 U/g),胰蛋白酶(4000 U/g),菠蘿蛋白酶(105U/g),木瓜蛋白酶(2×106U/g),堿性蛋白酶(105U/g),中性蛋白酶(105U/g),風(fēng)味酶(104U/g),海產(chǎn)品水解專用酶(105U/g),魚鱗魚皮膠原蛋白，水解專用酶(105U/g),酸性蛋白酶(104U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 美國(guó)sigma公司。

30L雙層玻璃反應(yīng)釜、DFY-20L/20低溫恒溫反應(yīng)浴 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;工業(yè)EDI純水機(jī) 杭州華麒水處理設(shè)備廠;Milli-Q超純水純化系統(tǒng) 美國(guó)millipore公司;管式離心機(jī) 上海浦東天本離心機(jī)有限公司;SG2便攜式pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;ICS3000離子色譜儀 戴安中國(guó)有限公司;AKTA全自動(dòng)蛋白層析系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；Epsilon 2-6D凍干機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 河豚魚皮膠原寡肽的制備 5 kg河豚魚皮,依次采用六倍體積的0.2% NaOH和0.3%H2SO4水溶液處理,洗至中性,加入5L純水,60℃恒溫加熱攪拌提取2h后,冷卻至室溫,以管式離心機(jī)過濾除渣,得到30L河豚魚皮的膠原提取液[12]。

1.2.2 一次酶解 分別選用十種常用的蛋白酶(胃蛋白酶,胰蛋白酶,菠蘿蛋白酶,木瓜蛋白酶,堿性蛋白酶,中性蛋白酶,風(fēng)味酶,海產(chǎn)品水解專用酶,魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶,酸性蛋白酶)加入到河豚魚皮膠原提取液中進(jìn)行一次酶解。按表1調(diào)節(jié)適合不同酶反應(yīng)的溫度和pH,加入等酶活的蛋白酶,進(jìn)行酶解,反應(yīng)時(shí)間為6h。反應(yīng)結(jié)束后,加熱滅酶活,離心后即得一次酶解液。

表1 不同蛋白酶的酶解反應(yīng)條件[13]Table 1 Conditions for specific protease enzymatic reaction[13]

1.2.3 二次酶解 選用除了第一步水解用酶的其它九種蛋白酶,對(duì)一次酶解液進(jìn)行再次酶解。具體方法同1.2.2。

1.2.4 二次酶解單因素實(shí)驗(yàn) 考察蛋白酶不同投酶量、酶解時(shí)間、酶解pH、溫度等因素對(duì)水解度的影響。

1.2.5 二次酶解正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行投酶量、酶解時(shí)間、酶解pH、溫度等四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),以確定最佳工藝。

1.2.6 膠原肽分子量的測(cè)定 采用AKTA全自動(dòng)蛋白層析系統(tǒng)對(duì)膠原肽的分子量分布進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)條件為:色譜柱Superdex 200 10/300 GL;流動(dòng)相:50mmol/L磷酸鹽、0.15mol/L氯化鈉、pH7.0的緩沖液;流速:0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):214nm;進(jìn)樣量:50μL。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別為:Cytochrome C(Mr=12384)、Aprotinin(Mr=6512)、Bacitracin A(Mr=1423)、(Gly)3(Mr=189)、Gly(Mr=75)。

1.2.7 膠原寡肽凍干粉基本成分的測(cè)定 取1000mL河豚魚皮膠原寡肽提取液,凍干成固體,測(cè)定其基本成分。

膠原肽含量的測(cè)定:采用離子色譜法以羥脯氨酸的含量進(jìn)行表征[14]?；曳值臏y(cè)定:GB 5009.4-2003。水分的測(cè)定:GB/T 5009.3-2003。

1.2.8 水解度的測(cè)定 采用甲醛法測(cè)定水解度[15]。取5 mL二次酶解液于小燒杯中,加入60 mL去二氧化碳水,用磁力攪拌器攪拌,用精密pH計(jì)指示其pH。配取0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至pH8.2,加入已中和(pH7.0)的甲醛溶液20 mL,記錄將其溶液pH滴定至9.2時(shí)所消耗的0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積。

式中：VNaOH:消耗的NaOH體積(mL)；CNaOH:所滴定的NaOH濃度(mol/L)；V樣品:樣品體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量分布

圖1為五種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量分布,按照出峰順序,從左到右依次為Cytochrome C(Mr=12384)、Aprotinin(Mr=6512)、Bacitracin A(Mr=1423)、(Gly)3(Mr=189)、Gly(Mr=75)。各標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)值對(duì)洗脫體積做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:lgMr=-0.246v+6.6697(R2=0.9959),式中v為洗脫體積,Mr為分子量。通過洗脫體積可以計(jì)算出膠原寡肽的分子量分布。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of standard proteins

表2 不同蛋白酶的水解度Table 2 Hydrolysis degree of specific protease

2.2 一次酶解

本實(shí)驗(yàn)選用了十種常見的蛋白酶分別加入到30L的河豚魚皮膠原提取液中進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn),酶解結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶和胰蛋白酶的水解效果最佳。其水解膠原多肽的分子量分布如圖2所示。根據(jù)洗脫體積可以計(jì)算出膠原多肽的分子量分布,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種蛋白酶的酶解液,膠原多肽的分子量分布基本相近,分子量范圍是在100～5000u。在實(shí)驗(yàn)過程中,酶解條件的優(yōu)化對(duì)水解液中膠原多肽的分子量范圍影響并不明顯,因此,要獲得分子量小于1000u的膠原寡肽還需進(jìn)行第二步酶解。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,主要采用胰酶的一次酶解液進(jìn)行再次酶解。

圖2 經(jīng)胰酶和魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶酶解的 河豚魚皮膠原多肽的分子量分布圖Fig.2 Molecular weight distribution of collagen peptide from puffer fish skin hydrolyzed by trypsin or fish scale collagen hydrolysis special enzyme

2.3 二次酶解實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

根據(jù)表1的實(shí)驗(yàn)條件,選擇除了第一步水解用酶的其它九種蛋白酶進(jìn)行二次酶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酸性蛋白酶的水解效果最佳,其水解膠原肽的分子量均小于1000u。因而選用酸性蛋白酶進(jìn)行二次酶解,并對(duì)其酶解條件作了進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.3.1 酶解時(shí)間的影響 在pH3.5,加酶量1%(m/v),酶解溫度為50℃的酶解條件下,用酸性蛋白酶進(jìn)行二次酶解,不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響如圖3所示。結(jié)果表明,酸性蛋白酶在反應(yīng)初期的2h內(nèi),活性較高,水解度迅速上升,而后繼續(xù)水解,雖然仍有所上升,但是上升幅度較小。當(dāng)酶解時(shí)間為6h后,酶解反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài),水解度變化緩慢,這可能是因?yàn)樵谒膺^程中,酶切位點(diǎn)逐漸減小,小分子寡肽已基本溶出。因此考慮到時(shí)間成本,選擇酶解時(shí)間為6h。

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis time on hydrolysis degree

2.3.2 酶解pH的影響 由圖4可知,酶解pH在3.0～5.0時(shí),水解度隨著pH的增加而增大,當(dāng)pH達(dá)到5.0時(shí),水解度達(dá)到最大值,而當(dāng)酶解pH大于5.0時(shí),水解度又逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這說明pH5.0時(shí),能最大限度地發(fā)揮酸性蛋白酶的酶活,因此確定最佳酶解pH為5.0。

圖4 不同pH對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of different pH value on hydrolysis degree

2.3.3 酶解溫度的影響 不同溫度對(duì)水解度的影響如圖5所示。酸性蛋白酶在30～60℃的酶解溫度范圍內(nèi),都具有較強(qiáng)的活性。從圖上可以看出,當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí),酸性蛋白酶的水解效果最佳,因此最適酶解溫度為50℃。

圖5 不同溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of different temperature on hydrolysis degree

2.3.4 投酶量對(duì)的影響 由圖6可知,當(dāng)酸性蛋白酶投酶量在0.2%～2%濃度范圍時(shí),水解度隨著酶添加量的升高而迅速增大,這是由于在酶解反應(yīng)初期,酸性蛋白酶作用于酶切位點(diǎn),使得寡肽逐漸釋放出來。但是,當(dāng)繼續(xù)增加投酶量,水解度的增幅緩慢?？紤]到生產(chǎn)成本,確定較適宜的酶添加量為2%。

圖6 不同投酶量對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of different enzyme concentration on hydrolysis degree

2.3.5 正交實(shí)驗(yàn) 酸性蛋白酶的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,水解度影響最大的是投酶量(C),然后依次是酶解時(shí)間(A)、酶解pH(B)、酶解溫度(D)。綜上結(jié)果,采用酸性蛋白酶進(jìn)行二次酶解的最佳工藝為A3B2C2D2,即酸性蛋白酶酶解時(shí)間8h,酶解pH4.5,投酶量2%,酶解溫度50℃。

表3 酸性蛋白酶酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

采用正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合進(jìn)行膠原蛋白二次水解,水解度為62%,所得膠原寡肽分子量分布均在1000u的范圍內(nèi),分子量分布較為集中,主要為100～600u,如圖7所示。經(jīng)測(cè)定,膠原寡肽凍干樣品的膠原肽含量為94.0%,灰分為0.71%,水分為5.2%。

圖7 魚皮膠原寡肽的分子量分布圖Fig.7 Molecular weight distribution of collagen oligopeptide from puffer fish skin

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以河豚魚皮作為原料,先用酸堿進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行提取,獲得到河豚魚皮明膠,再?gòu)氖N常用的蛋白酶中選取魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶、海產(chǎn)品水解專用酶或胰蛋白酶進(jìn)行一次酶解,酶解得到的河豚魚皮膠原多肽分子量范圍是在100～5000u。最后采用酸性蛋白酶進(jìn)行二次酶解,并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件,確定最佳工藝條件為酸性蛋白酶投酶量2%,酶解時(shí)間8h,酶解pH4.5,酶解溫度50℃,制備得到的河豚魚皮膠原寡肽分子量分布主要集中在100～600u。本研究以水產(chǎn)加工業(yè)產(chǎn)生的大量河豚魚皮副產(chǎn)物作為原料制備膠原寡肽,實(shí)現(xiàn)了資源的高值化利用,可為今后的規(guī)模化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Optimization of preparation process of collagen oligopeptide from puffer fish skin

GUO Hong-hui,HONG Zhuan*,ZHANG Yi-ping,CHEN Si-jin,LI Huang-ting

(Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration,Xiamen 361005,China)

The best preparation process of collagen oligopeptide from puffer fish skin by two-step enzymatic hydrolysis was studied. Taking hydrolysis degree and molecular weight as indices,the hydrolysis conditions were optimized by the single factor experiments and orthogonal tests. The results showed that the first-step optimal enzyme was fish scale collagen hydrolysis special enzyme or trypsin and the second-step optimal enzyme was acid protease. The optimal hydrolysis conditions of acid protease were found to be reaction at 50℃ and pH of 4.5 for 8h with protease concentration of 2%.The molecular weight of prepared collagen oligopeptide ranged from 100u to 600u. The collagen peptide,ash and water content of the lyophilized sample was respectively 94.0%,0.71%,and 5.2%.

fish skin;collagen oligopeptide;hydrolysis degree;orthogonal test

2014-04-08

郭洪輝(1982-)，女，博士，助理研究員，主要從事海洋生物資源綜合利用研究。

*通訊作者:洪專(1970-)，男，碩士，教授級(jí)高工，主要從事海洋生物毒素、海洋生物蛋白、海洋生物多糖、海洋脂類物質(zhì)等領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)研究與開發(fā)、中試和研究成果工程化轉(zhuǎn)化研究，以及海洋生物活性天然產(chǎn)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品研發(fā)。

國(guó)家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(海三科2013029)；廈門海洋研究開發(fā)院共建項(xiàng)目(2014)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205022-8)；海洋生物產(chǎn)業(yè)化中試技術(shù)研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)(12PZP001SF10)；國(guó)家青年科學(xué)基金(41106149)。

TS254.1

B

1002-0306(2015)01-0198-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.032