離子交換法分離發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸

劉延嶺,鄧 林

(四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川都江堰 611830)

離子交換法分離發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸

劉延嶺,鄧 林

(四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川都江堰 611830)

研究了ε-聚L-賴氨酸發(fā)酵液前處理的工藝條件。以蛋白質(zhì)和ε-聚L-賴氨酸濃度為指標,分別使用5mol/L氫氧化鈉于pH8.5沉淀蛋白質(zhì)和5ku的聚砜超濾膜進行超濾,達到了良好的去除雜蛋白的效果。同時探討了離子交換法分離發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸的工藝。以ε-聚L-賴氨酸吸附量為指標,采用靜態(tài)吸附法選擇合適的樹脂:弱酸型HD-2陽離子交換樹脂,其最大吸附量可達到28.8mg/g。

離子交換法,分離,ε-聚L-賴氨酸

離子交換法是根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物的酸堿度、極性和分子大小而進行的分離純化技術(shù)。在發(fā)酵工業(yè)中,蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶及抗生素等常用離子交換樹脂法進行分離提純[1]。離子交換法具有成本低、操作方便、提取率高、設(shè)備簡單等優(yōu)點。

ε-聚L-賴氨酸(ε-Poly-L-lysine)是由L-賴氨酸的ε-氨基和另一個賴氨酸的α-羧基之間形成的ε-酰胺鍵連接而形成的一種氨基酸同型化合物[2],可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的[3-6]。由于ε-聚L-賴氨酸具有廣譜抗菌性,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果,目前已廣泛應(yīng)用到食品工業(yè)的各個領(lǐng)域,如用于面包點心、奶制品、肉制品、冷藏食品和袋裝食品等[7]。

基于ε-聚L-賴氨酸優(yōu)良的防腐性能及其廣泛的應(yīng)用前景,近年來其發(fā)酵生產(chǎn)和提取工藝成為了國內(nèi)外研究的熱點。在前期的實驗中,已分離篩選出一株生產(chǎn)菌株[8]。本實驗主要針對發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸的提取進行研究。探索了發(fā)酵液預(yù)處理的工藝,并考察不同離子交換樹脂對發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸的吸附和解吸性能,確定適用于分離提純ε-聚L-賴氨酸的樹脂類型,以期為ε-聚L-賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ε-聚L-賴氨酸生產(chǎn)菌株白色鏈霉菌(Streptomyces albus) 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院篩選保藏;種子培養(yǎng)基 葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、硫酸銨1g/L、磷酸二氫鉀1.2g/L、磷酸氫二鉀1.2g/L、硫酸鎂0.03g/L、硫酸亞鐵0.01g/L、pH6.8;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖40g/L、酵母膏8g/L、硫酸銨1.2g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L、硫酸鎂0.05g/L、pH6.8;ε-聚L-賴氨酸標準品 Sigma公司;考馬斯亮藍G-250 北京西美杰科技有限公司;所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純;實驗使用的三種樹脂分別為強酸型陽離子交換樹脂苯乙烯系列734#、弱酸型陽離子交換樹脂丙烯酸系列HD-2和D152,其基本性狀見表1。

表1 3種樹脂的基本性狀Table 1 Basic properties of three types of ion exchange resins

T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;KH30RF高速冷凍離心機 凱達科學(xué)儀器有限公司;卷式膜超濾小型實驗機 濟南博納生物技術(shù)有限公司;3200P pH測量儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵種子液的制備 用接種環(huán)挑取一環(huán)新鮮培養(yǎng)的孢子,接種到種子培養(yǎng)基中,30℃,180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)36h。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 將種子培養(yǎng)液按3%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72h[9]。

1.2.3 發(fā)酵液預(yù)處理工藝的選擇 根據(jù)劉潔萍[9-12]等人的實驗,從發(fā)酵液中分離ε-聚L-賴氨酸時預(yù)處理去除雜蛋白有三種方法:濾紙過濾、調(diào)節(jié)pH和超濾膜過濾。綜合三種方法,本實驗采用先調(diào)節(jié)pH再超濾的方法對發(fā)酵液進行預(yù)處理。

將發(fā)酵液于5000r/min條件下離心15min,收集上清液,向上清液中加入5%三氯乙酸或5mol/L氫氧化鈉后,調(diào)節(jié)pH為3、5、6、7、8、9、10。調(diào)節(jié)上清液pH后,溶液中立即產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀。靜置30min,2000r/min進行離心,分別測定離心液中蛋白質(zhì)濃度和ε-聚L-賴氨酸濃度,以確定發(fā)酵液預(yù)處理時最佳pH。

1.2.4 發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量的測定 按照考馬斯亮藍G-250染色法進行測定。

1.2.5 ε-聚L-賴氨酸含量的測定 使用改進的Itzhaki方法進行測定[13]。

1.2.5.1 標準曲線的制作 取0.2mL ε-聚L-賴氨酸濃度為0～0.12g/L的標準液與0.5mL 500μmol/L甲基橙溶液混合,30℃振蕩反應(yīng)30min,4000r/min離心15min,將上清液用0.05mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)稀釋10倍,于464nm處測定吸光度,以磷酸鉀緩沖液與甲基橙反應(yīng)為空白對照。

1.2.5.2 ε-聚L-賴氨酸含量的測定 取發(fā)酵上清液2mL與0.5mL 500μmol/L甲基橙溶液混合,30℃下振蕩30min,4000r/min離心15min,將上清液用0.05mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)稀釋10倍后于464nm處測吸光度。

1.2.6 樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能測定 稱取按說明書預(yù)處理后的三種不同類型的濕樹脂各5g,置于250mL磨口錐形瓶中,加入預(yù)處理后的發(fā)酵液200mL,25℃振蕩12h后繼續(xù)保溫靜置,于不同時段測定吸附后發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸的濃度[14]。按公式(1)計算吸附量。

式(1)

式中:c0為初始濃度(mg/mL);c1為吸附后濃度(mg/mL);V為吸附體積(mL);m為樹脂量(g)。

將上述吸附已飽和的各型樹脂過濾,取一定量加入適量蒸餾水洗滌,再加入200mL 0.1mol/L的鹽酸進行洗脫,25℃振蕩12h后測定洗脫液中ε-聚L-賴氨酸的濃度。按公式(2)計算各樹脂在室溫下的解吸率。

式(2)

式中:c為洗脫液中ε-聚L-賴氨酸濃度(mg/mL);V為洗脫液體積(mL);m為樹脂質(zhì)量(g);Q為吸附量(mg/g)。

1.2.7 弱酸性HD-2樹脂的靜態(tài)吸附曲線 稱取5g弱酸型HD-2樹脂于250mL錐形瓶中,加入200mL經(jīng)預(yù)處理后的發(fā)酵液,于25℃恒溫振蕩吸附,每隔1h取樣測定吸附結(jié)果,繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.2.8 HD-2樹脂的最大吸附量測定 稱取5g弱酸型HD-2型樹脂于250mL錐形瓶中,每隔1h加入100mL經(jīng)預(yù)處理后的發(fā)酵液,于25℃恒溫振蕩吸附,直至樹脂吸附達到飽和為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 ε-聚L-賴氨酸標準曲線的繪制

由圖1可知,ε-聚L-賴氨酸濃度在0～0.1g/L范圍內(nèi)與吸光度存在線性關(guān)系。根據(jù)標準曲線,可以快速的計算出ε-聚L-賴氨酸的濃度。

圖1 ε-聚L-賴氨酸標準曲線Fig.1 The calibration curve of ε-poly-L-lysine

表2 3種離子交換樹脂對ε-聚L-賴氨酸的靜態(tài)吸附與解吸Table 2 The static adsorption capacity and desorption rates of 3 resins of ε-Ploly-L-lysine

2.2 發(fā)酵液的預(yù)處理

2.2.1 預(yù)處理pH的選擇 通過測定可知發(fā)酵液pH為4.2。由圖2可知,在pH8和pH9的條件下,所得離心液中蛋白質(zhì)濃度較小,且ε-聚L-賴氨酸濃度較大。說明在此pH條件下雜蛋白去除效果好,ε-聚L-賴氨酸損失也少。綜合考慮,發(fā)酵液預(yù)處理中選擇使用5mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH8.5,去除雜蛋白。

圖2 不同pH條件下預(yù)處理發(fā)酵液的結(jié)果Fig.2 The results of broth after pretreatment at different pH

2.2.2 超濾法預(yù)處理結(jié)果 ε-聚L-賴氨酸是L-賴氨酸的聚合物,由25～35個L-賴氨酸殘基通過α-羧基與ε-氨基連接聚合而成。根據(jù)文獻資料,其分子量一般為5ku左右[11]。因此,選擇截留分子量為5ku的聚砜超濾膜對去除雜蛋白后的發(fā)酵液進行超濾,目的是除去部分大分子蛋白質(zhì)。使用去除雜蛋白后的發(fā)酵液進行超濾,測定超濾后所得透過液和截留液中的蛋白質(zhì)和ε-聚L-賴氨酸濃度,結(jié)果見圖3。

圖3 超濾處理發(fā)酵液的結(jié)果Fig.3 The results of broth after supernatant treatment

由圖3可知,通過超濾法預(yù)處理后,透過液的蛋白質(zhì)濃度明顯降低,而截留液中蛋白質(zhì)濃度相對較高,說明大部分大分子蛋白質(zhì)被截留。同時,ε-聚L-賴氨酸在超濾前后濃度變化不大,說明超濾法具有可行性和有效性。

2.3 三種離子交換樹脂對ε-聚L-賴氨酸的靜態(tài)吸附-解吸實驗

所選三種樹脂對ε-聚L-賴氨酸的靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果見表2。

由表2所知,從吸附效果來看,3種樹脂均對ε-聚L-賴氨酸具有一定的吸附能力,其中,弱酸型陽離子交換樹脂HD-2型的吸附效果最好,強酸型陽離子交換樹脂苯乙烯系列734#的吸附效果次之,弱酸型陽離子交換樹脂D152型的吸附效果最差。解吸效果來看,弱酸型陽離子交換樹脂HD-2型的解吸效果最好,能夠較容易地解析下目的產(chǎn)物,而強酸型陽離子交換樹脂苯乙烯系列734#的吸附效果較差,ε-聚L-賴氨酸損失也較多。

綜合以上3種樹脂的吸附和解吸結(jié)果,選擇弱酸型的HD-2型樹脂進一步研究。

2.4 弱酸性HD-2樹脂的靜態(tài)吸附曲線

由圖4可以看出,HD-2樹脂對發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸的吸附為快速平衡型。在6h之前,吸附量隨著時間的增加而增大,到達6h后,吸附量增加緩慢,達到平衡。

圖4 弱酸性HD-2型樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.4 Static adsorption curve of ε-poly-L-lysine on HD-2 resin

2.5 HD-2樹脂的最大吸附量測定

HD-2樹脂的最大吸附量測定結(jié)果見圖5?？梢钥闯?5g弱酸型HD-2樹脂最多可以吸附約800mL發(fā)酵液,最大吸附量達到28.8mg/g。

圖5 HD-2樹脂的最大吸附量測定結(jié)果Fig.5 The maximum adsorption capacity of ε-poly-L-lysine on HD-2 resin

3 結(jié)論

3.1 研究了ε-聚L-賴氨酸發(fā)酵液前處理的工藝條件。采用先調(diào)節(jié)pH再超濾的方法對發(fā)酵液進行預(yù)處理。分別使用5mol/L氫氧化鈉于pH8.5沉淀蛋白質(zhì)和5ku的聚砜超濾膜進行超濾,達到了良好的去除雜蛋白的效果。

3.2 研究了離子交換法分離提取發(fā)酵液中ε-聚L-賴氨酸的方法。篩選出了弱酸型HD-2陽離子交換樹脂,其最大吸附量可達到28.8mg/g。

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Study on the seperation of ε-poly-L-lysine from fermentation broth by ion exchange method

LIU Yan-ling,DENG Lin

(Sichuan Technology and Business College,Dujiangyan 611830,China)

The pretreatment ofStreptomycesalbusfermentation broth was studied in order to obtain ε-poly-L-lysine in it. 5mol/L NaOH was added into broth to adjust the pH8.5 in order to precipitate the protein,then 5ku polysulfone membrane was used in ultrafiltration,through which the most impurity protein was removed. The process conditions of ion exchange were also discussed in detail. The weakly acidic cation exchanger resin HD-2 was selected as the best through static adsorption method with the adsorption capacity as index. The maximum adsorption capacity of ε-poly-L-lysine on HD-2 resin was 28.8mg/g.

ion exchange method;separation;ε-poly-L-lysine

2014-04-03

劉延嶺(1973-)，男，本科，高級工程師，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)01-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.007