TSLP基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建

廖智萍，郭永清（通訊作者），方文旭，蔡志福

（1.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，福建莆田351100；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院 耳鼻咽喉科，福建廈門361004）

TSLP基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建

廖智萍1，郭永清2（通訊作者），方文旭1，蔡志福1

（1.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，福建莆田351100；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院 耳鼻咽喉科，福建廈門361004）

目的：構(gòu)建TSLP基因的原核載體pGEX-4T-1／TSLP并將其轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL-21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，最后獲得基因表達(dá)產(chǎn)物。方法：用PCR方法從含有TSLP全基因序列中擴(kuò)增目的基因，將TSLP基因連接到pGEX-4T-1質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21（DE3）中。最后檢測TSLP基因。結(jié)果：經(jīng)測序及PCR證實TSLP準(zhǔn)確插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中SDS-PAGE及Western blotting分析證明重組蛋白的分子量約為40KD。結(jié)論：成功構(gòu)建表達(dá)了含有TSLP的原核重組載體，并在大腸桿菌中表達(dá)。

胸腺基質(zhì)淋巴生成素（TSLP）；pGEX-4T-1／TSLP構(gòu)建；重組載體

變應(yīng)性鼻炎和鼻息肉是耳鼻咽喉科的常見病和多發(fā)病，近幾年來其發(fā)病率呈上升趨勢，變應(yīng)性鼻炎是發(fā)生在鼻黏膜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，鼻息肉的發(fā)病機(jī)制至今不清楚，已有研究提示變態(tài)反應(yīng)在鼻竇炎鼻息肉的發(fā)病中起了重要作用。胸腺基質(zhì)淋巴生成素（TSLP）是最近研究比較熱門的一種細(xì)胞因子，研究者表明TSLP與變應(yīng)性疾病的發(fā)病密切相關(guān)［1，2］。本文試圖通過獲取TSLP基因重組載體，進(jìn)一步探究TSLP的致病機(jī)制，進(jìn)而希望為開發(fā)治療變應(yīng)性疾病的藥物提供某些實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料：表達(dá)帶有GST標(biāo)簽pGEX-4T-1載體?；蚬こ叹鶨.coli DH5α和BL21（DE3）（由廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化實驗室贈送）。EcoRI、SalI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，Taq酶，以及PCR反應(yīng)試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品。DL15000 Marker、DNA Marker1，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA小量膠回收純化試劑盒。異丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）以及氨芐西林均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)入試劑盒（MBI），Mouse anti-TSLP單克隆抗體（R＆D公司），HRP標(biāo)記Goat anti-Mouse IgG，ECL為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物合成：參考GenBanK中TSLP全長基因的序列，應(yīng)用primer primier5.0設(shè)計一對可擴(kuò)增TSLP基因開放讀碼框區(qū)域的引物：上游引物PF：5＇-CCGGAATTCCGGGTGTCCACGTATGTTC-3（畫線部分為EcoRI的酶切位點），下游引物PR：5＇-CCGGTCGACGATGGTTTACTGTTGTTTCAG-3＇（畫線部分為的SalI酶切位點），（由上海英駿生物工程有限公司合成）。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增：人鼻黏膜上皮細(xì)胞總RNA的提取：按Trizol試劑盒所述方法提取人鼻黏膜RNA。-80℃，保存?zhèn)溆谩Ｒ設(shè)ligo（dT）18為引物，遵循cDNA Synthesis System操作步驟合成cDNA。以cDNA為模板，以人TSLP基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性2min，以95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，再于72℃延伸10min。同時設(shè)立無模板的陰性對照。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的DNA片段的膠條用膠回收試劑盒回收。

1.2.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1／TSLP的構(gòu)建與鑒定：將純化的PCR產(chǎn)物和載體pGEX-4T-1用EcoRI和SalI雙酶切后，分別回收酶切產(chǎn)物，在T4 DNA連接酶作用下定向?qū)SLP基因片段與pGEX-4T-1連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在LB（Amp＋）培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取克隆，培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，用EcoRI和SalI雙酶切鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定：（1）重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析：將鑒定成功的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21，在LB（Amp＋）培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coli BL21在LB（Amp＋）培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。以1%接種于LB（Amp＋）培養(yǎng)液中，于37℃培養(yǎng)至A600nm約為0.6時，加入1 mmol／L IPTG，于30℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，經(jīng)超聲碎菌后，提取菌體全蛋白，將菌體全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%）分析后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色30min，用甲醇-冰醋酸脫色液脫色后觀察結(jié)果。另外，取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、4、6h的裂解菌液及超聲裂解菌離心后的上清和沉淀，分別進(jìn)行12%SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達(dá)與誘導(dǎo)時間的關(guān)系，以及目的蛋白的表達(dá)形式。（2）Western blot分析：將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS -PAGE后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）上，用封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）室溫振蕩封閉2 h。依次滴加Mouse anti-TSLP單克隆抗體（室溫反應(yīng)1.5 h）及HRP標(biāo)記Goat anti-Mouse IgG（室溫反應(yīng)1 h），用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒底物液顯色后，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 TSLP基因的擴(kuò)增與鑒定結(jié)果：人鼻黏膜上皮細(xì)胞TSLP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲產(chǎn)物在2g／L瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，在紫外燈下觀察到1條約500bp的帶，同預(yù)期的目的片段的大小相符（圖1）。

圖1 TSLP基因片段PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定［M：DNA marker；1.2：PCR產(chǎn)物；3：陰性對照（without TSLP tem-plate）］。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1／TSLP的酶切鑒定（1.pGEX-4T-1／TSLP／EcoRI、SalI；2.pGEX-4T-1／TSLP／EcoRI；3.pGEX-4T-1／TSLP／SalI M：MAKER）

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX-4T-1／TSLP的構(gòu)建圖略。將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1／TSLP用EcoRI、SalI分別進(jìn)行單酶切及雙酶切，pGEX-4T-1的大小約為4.9 kb，擴(kuò)增產(chǎn)物TSLP基因的大小約為509bp，線狀重組質(zhì)粒的大小為5.4kb，說明重組質(zhì)粒大小正確。pGEX-4T-1／TSLP經(jīng)EcoRI、SalI雙酶切后，分成4.9 kb和0.5 kb兩個片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已正確插入pGEX-4T-1載體中（圖2）。陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)進(jìn)行BLAST分析比對，與GenBank登入的基因的序列完全一致（圖3）

圖3 陽性重組質(zhì)粒測序圖

圖4 GST-TSLP融合蛋白的SDS-PAGE分析［1.no induced pGEX-4T -1／TSLP；2.induced pGEX-4T-1／TSLP（2h）；3.induced pGEX-4T-1／TSLP（3h）；4.induced pGEX-4T-1／TSLP（4h）；5.induced pGEX-4T-1／TSLP（5h）；］

2.3 GST-TSLP融合蛋白的表達(dá)與鑒定結(jié)果：以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21，挑取陽性克隆后進(jìn)行酶切鑒定。將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物用SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，在Mr為40KD處有1條明亮帶，同預(yù)期的目的蛋白的Mr相符，Mr 26KD處條帶為融合蛋白GST-TSLP受細(xì)菌內(nèi)蛋白酶的作用而降解產(chǎn)生的GST蛋白。表達(dá)時間分析表明，目的蛋白在誘導(dǎo)4 h時表達(dá)量最高（圖4）。表達(dá)形式分析表明，目的蛋白大多以可溶性非包涵體形式存在于胞質(zhì)中。將融合蛋白GST-TSLP經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，用抗TSLP抗體檢測顯示，在Mr為40 KD處有1條明顯的帶，預(yù)計TSLP的大小約14KD（圖5）。

圖5 GST-TSLP融合蛋白的Western blot分析（1.2均為GST-TSLP融合蛋白，大小約40KD）

3 討論

變應(yīng)性疾病是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜疾病，隨著對鼻息肉和過敏性鼻炎的基礎(chǔ)研究日益深入，我們認(rèn)識到其發(fā)病和轉(zhuǎn)歸有許多復(fù)雜的細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和大量免疫活性物質(zhì)參與。TSLP基因是1994年 Friend等首次從胸腺基質(zhì)細(xì)胞中鑒定出來，由A、B、C、D 4個螺旋束組成短鏈的I型細(xì)胞因子，研究表明，TSLP對淋巴細(xì)胞的發(fā)育、分化，尤其對樹突狀細(xì)胞的活化、分化起著重要的調(diào)控作用［3-4］，研究顯示受TSLP作用而被激活的CD11C＋DC，可促進(jìn)幼稚CD4＋T細(xì)胞增殖，分泌大量IL-4，IL-5及TNF-α。同時，CD8＋T細(xì)胞在TSLP激活DC的作用下，可產(chǎn)生大量INF-γ，IL-5和IL-13。INF-γ，IL-5和IL-13水平的升高，可導(dǎo)致炎性反應(yīng)的加劇以及組織損傷，表明TSLP可能是炎癥發(fā)生過程中一個重要的啟動因子。鑒于TSLP具有的重要的免疫學(xué)功能及生理、病理學(xué)意義，探究TSLP在變應(yīng)性疾病中的發(fā)生機(jī)制，因此尋找新的治療方案及將多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用是變應(yīng)性疾病治療研究的熱點。

選擇有效的表達(dá)系統(tǒng)是進(jìn)行外源基因高效表達(dá)的重要前提，本研究中利用分子克隆技術(shù)研究TSLP在原核基因的表達(dá)，明確誘導(dǎo)表達(dá)條件和目的蛋白的大小，因表達(dá)量是隨著誘導(dǎo)劑量的增高而增高，但誘導(dǎo)劑對宿主菌有一定的毒害作用。我們將誘導(dǎo)時間定為2～6h，分別用9個不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)。電泳分析，確定1mmol／L為最佳濃度。本實驗采用1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)濃度，分別誘導(dǎo)2～6h，電泳分析，確定4h為最佳誘導(dǎo)時間。外源基因表達(dá)為融合蛋白，分子量約為40 kD，在SDS-PAGE膠上的表觀分子量基本符合此值，其中表達(dá)產(chǎn)物的N末端有一段含有GST標(biāo)簽的融合蛋白，大約為26 kD，此標(biāo)簽有利于目的蛋白的純化。表達(dá)的GSTTSLP融合蛋白可用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析的方法純化，GST序列后有一個可被凝血酶和Xa因子識別的蛋白酶切位點，通過蛋白酶的切割可產(chǎn)生天然的TSLP蛋白，為研究其抗原性提供了必要的條件。

本試驗成功構(gòu)建表達(dá)了含有TSLP的原核重組載體，并在大腸桿菌中表達(dá)，通過本試驗所摸索的培養(yǎng)條件，我們可獲得足夠的融合蛋白，為進(jìn)一步研究TSLP的抗原性和其抗體的免疫保護(hù)性奠定基礎(chǔ)，為TSLP在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床應(yīng)用等方面的研究提供了一定的理論和實驗依據(jù)。

［1］Wang Y H，Liu Y J.Thymic stromal lymphopoietin，OX40-ligand，and interleukin-25 in allergic responses［J］.Clinical and Experimental Allergy，2009，86：236.

［2］Harada M，Hirota T，Jodo AI，et al.Functional analysis of the thymic stromal lymphopoietin variants in human bronchial epithelialcells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol.2009，71：236.

［3］Yong-Jun Liu.Thymic stromal lymphopoietin：master switch for allergic infl ammation［J］.The Journal of Experimental Medicine，2006，122：310.

［4］Liu YJ，Soumelis V，Watanabe N，et al.TSLP：an epithelial cell cytokine that regulates T cell differentiation by conditioning dendritic cell maturation［J］.Annual Review of Immunology，2007，106：281.

Construction of prokaryotic expression vector of TSLP gene

Liao Zhiping1，Guo Yongqing2（correspondence author），F(xiàn)ang Wenxu1，Cai Zhifu1
1.Department of Fujian，Putian 351100；2.Department of Zhongshan hospital，hospital，Xiamen，F(xiàn)ujian，China 361004

Objective：to build arrives at genetic prokaryotic carrier pGEX-4 t-1／arrives and transfer them to the e.coli BL-induced expression in21（DE3），finally get the gene expression product.Methods：from containing arrives at full genetic sequence by polymerase chain reaction（PCR）amplification of gene，connect the arrives at gene plasmids pGEX-4 t-1，and go to the e.coli BL21（DE3）.Finally arrives at DNA.Results：confirmed by sequencing and PCRarrives accurately inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4 t-1 in sds-page and Western blotting analysis shows that the molecular weight of the recombinant protein is about 40 kd.Conclusion：successful build containing arrives at the prokaryotic recombinant expression vector，and expressed in escherichia coli.

Thymic stromal lymphopoietin（TSLP）；pGEX-4T-1／TSLP construction；recombinant carrier

R596

A

1002-2376（2015）10-0001-02

2015-08-25