烏骨藤多糖抗腫瘤作用的實驗研究

樊丹怡 常 宏 蔣紹艷 鄧少潔 何 珊

廣東省深圳市婦幼保健院，廣東 深圳 518028

實驗研究

烏骨藤多糖抗腫瘤作用的實驗研究

樊丹怡 常 宏 蔣紹艷 鄧少潔 何 珊

廣東省深圳市婦幼保健院，廣東 深圳 518028

目的：研究烏骨藤多糖的抗腫瘤活性及可能機制。方法：腹腔注射給予S180荷瘤小鼠模型低（100mg／kg）、中（200mg／kg）、高（400mg／kg）劑量的烏骨藤多糖，考察其對荷瘤小鼠抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、IL－2及TNF－α水平的影響。結(jié)果：與模型組比較，各給藥組均可顯著抑制腫瘤生長（P＜0.01），同時，可以明顯增加脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、IL－2及TNF－α水平（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：烏骨藤多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機制可能與免疫調(diào)節(jié)作用有關。

烏骨藤多糖；抗腫瘤；免疫功能

惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在許多地區(qū)和國家均高居首位，嚴重威脅人類健康和生命，而現(xiàn)有的放療、化療等治療手段均不能令人滿意，其中化療藥物具有耐藥性、毒副作用大等缺點，嚴重影響臨床效果［1］。因此，尋找低毒、高效的抗腫瘤藥物就顯得極為迫切。烏骨藤為蘿藦科植物通關藤Marsdenia tenacissima（Roxb．）Wightet Am．的藤莖，始載于 《滇南本草》，主產(chǎn)于貴州、云南等地［2］。烏骨藤復方制劑及其單味藥材制成的片劑、注射劑等已經(jīng)應用在直腸癌、胃癌、肺癌、食道癌等惡性腫瘤的治療中，取得較好效果［3－4］。但迄今為止，烏骨藤的抗腫瘤活性成分尚不明確，其研究主要集中在三萜類、甾體苷類等成分，關于烏骨藤多糖活性研究方面的報道較少［5］。本研究擬通過提取、分離制得烏骨藤多糖，然后通過給予S180荷瘤小鼠烏骨藤多糖30 d后，探討其是否具有抗腫瘤作用及可能的抗腫瘤機制，為研究和開發(fā)以烏骨藤多糖為主要成分的抗腫瘤藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物及瘤株 昆明種小鼠，健康清潔級，雌雄各半，體重為 （20±2）g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司；S180肉瘤購自美國ATCC細胞庫，并定期腹腔接種傳代保存。

1.2 藥品與試劑 烏骨藤購自本地藥材市場，經(jīng)鑒定為蘿藦科植物通關藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wightet Am.的藤莖；環(huán)磷酰胺由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；白細胞介素－2（IL－2）檢測試劑盒和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）檢測試劑盒購自南京建成生物。

1.3 實驗儀器 Elx800型酶標儀，美國Bio－Tek公司；5417R型超高速離心機，德國Eppendorf公司；AL204型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；2100型紫外分光光度計，美國Unico公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法

2.1.1 烏骨藤多糖的提取、分離 烏骨藤經(jīng)蒸餾水洗凈后烘干，粉碎過40目篩，用70%乙醇滲漉；加30倍蒸餾水煎煮3次，每次1h，過濾后合并濾液；濾液加熱濃縮至原體積的1／5，加活性炭脫色，過濾；濾液中加適量預冷的95%乙醇，使其終濃度為70%，放置過夜析出沉淀；離心后得沉淀，沉淀用少量蒸餾水溶解，濾去不容物后，再加入適量95%乙醇進行二次沉淀，沉淀物干燥后得烏骨藤多糖；采用苯酚－硫酸法測烏骨藤多糖含量。

2.1.2 荷瘤小鼠模型的建立、分組及給藥 60只昆明種小鼠隨機分成正常對照組、模型組、環(huán)磷酰胺組（20mg／kg）、烏骨藤多糖低（100mg／kg）、中（200mg／kg）、高（400mg／kg）劑量組。按文獻 ［6］方法，在無菌條件，取接種7d后生長良好的S180腫瘤細胞，用生理鹽水調(diào)成2×106個／m l的細胞懸液，除正常對照組外，各組小鼠右前肢接種0.2 ml。接種24h后給藥，環(huán)磷酰胺組ip給藥，隔天1次；烏骨藤多糖組ip給藥，每天1次；正常對照組及模型組ip等體積的生理鹽水，給藥周期為30 d。

2.1.3 烏骨藤多糖的抗腫瘤作用及對脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 末次給藥后次日稱量小鼠體重，眼球取血后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟和胸腺，計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，公式如下：

脾臟脂數(shù)＝脾重（mg）／體重（g）

胸腺指數(shù)＝胸腺重 （mg）／體重 （g）

剖取瘤組織，稱重后計算抑瘤率，公式如下：抑瘤率 （%）＝（模型組瘤重－實驗組瘤重）／模型組瘤重×100%

2.1.4 烏骨藤多糖對荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影響 將2.1.3中取得的血樣離心后，分離血清，然后按照試劑盒說明書中操作步驟檢測荷瘤小鼠血清中IL－2和TNF－α的水平。

2.1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用表示連續(xù)變量，采用t檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 實驗結(jié)果

2.2.1 烏骨藤多糖的提取、分離 制得的烏骨藤多糖為淺灰色粉末，其提取率為5.1% （相對于被提取的烏骨藤干重），純度為87.6%。

2.2.2 烏骨藤多糖的抗腫瘤作用及對脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 與模型組比較，烏骨藤多糖低、中、高劑量給藥組的腫瘤質(zhì)量均明顯減輕（P＜0.01），表明其具有顯著的抗腫瘤作用，低、中、高劑量組的抑瘤率分別為22.45%、32.65%和34.69%；同時，與模型組相比，烏骨藤多糖各給藥組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而環(huán)磷酰胺組中此2項指標則明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），提示烏骨藤多糖的毒副作用要明顯小于環(huán)磷酰胺。

表1 烏骨藤多糖的抗腫瘤作用及對脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 （±s，n＝10）

表1 烏骨藤多糖的抗腫瘤作用及對脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 （±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量／mg／kg脾臟指數(shù)／mg／g胸腺指數(shù)／mg／g瘤重／g抑瘤率／%對照 — 12.69±2.56** 4.34±0.82**— —模型 — 8.42±1.53 2.11±0.47 0.49±0.12 0.00環(huán)磷酰胺 20 8.09±1.31* 1.76±0.82** 0.26±0.09** 46.94烏骨藤多糖（低） 100 9.76±1.28* 2.89±0.94** 0.38±0.11** 22.45烏骨藤多糖（中） 200 10.52±1.65** 3.15±1.16** 0.33±0.08** 32.65烏骨藤多糖（高） 400 11.04±1.88** 3.54±1.02** 0.32±0.13**34.69

2.2.3 烏骨藤多糖對荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影響 與模型組相比，烏骨藤多糖中、高劑量組的IL－2水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而低劑量組雖然有一定程度增加，但差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；與模型組相比，烏骨藤多糖低、中、高劑量組的TNF－α水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且具有劑量依賴關系，以上結(jié)果提示烏骨藤多糖的抗腫瘤作用可能是通過提高免疫功能而起作用。

表2 烏骨藤多糖對荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影響（Pg／ml，±s，n＝10）

表2 烏骨藤多糖對荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影響（Pg／ml，±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量／mg／kg IL－2 TNF－α對照 — 442.18±30.78**100.63±15.04**模型 — 321.42±21.17 56.81±9.27環(huán)磷酰胺 20 310.69±15.38 82.36±10.22**烏骨藤多糖（低）100 331.42±21.27 67.25±11.48*烏骨藤多糖（中）200 354.33±15.56* 77.85±13.64**烏骨藤多糖（高）400 373.83±20.28**80.08±13.08**

3 討論

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏骨藤多糖可不同程度的抑制S180肉瘤的增長，但是抑瘤效果要低于陽性藥物環(huán)磷酰胺；但環(huán)磷酰胺在起到抗腫瘤作用的同時，可以明顯降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，表明其具有較大的毒副作用；而烏骨藤多糖可以增加荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，表明烏骨藤多糖毒副作用較小。新藥的研究開發(fā)要以安全、有效為準則，其中安全性更為重要［7］。因此，烏骨藤多糖在臨床應用方面將會具有較好的前景。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程極為復雜，目前為止，并沒有完全闡述清楚；但多項研究表明，免疫功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［8］。機體的免疫功能主要包括體液免疫和細胞免疫，尤其是細胞免疫在清除腫瘤過程中起著主導作用。IL－2和TNF－α為評價機體細胞免疫水平的重要指標，在腫瘤的免疫治療中受到越來越廣泛的重視。多項研究表明，植物多糖除了具有對腫瘤細胞的直接殺傷作用外，還可以通過促進細胞免疫反應而間接發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用［9－10］。本研究通過給予荷瘤小鼠不同劑量的烏骨藤多糖后發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，低、中、高劑量的烏骨藤多糖均可以增加荷瘤小鼠血清IL－2水平，其中中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；同時，與模型組比較，各劑量組的烏骨藤多糖也可以顯著增加荷瘤小鼠血清TNF－α水平（P＜0.05或P＜0.01）。因此，可以推測烏骨藤多糖可以通過促進免疫因子的產(chǎn)生，增加機體免疫能力，從而起到抑制腫瘤發(fā)展的作用。

綜上所述，烏骨藤多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機制可能與免疫調(diào)節(jié)作用有關。

［1］Hurwitz M，Stauffer P.Hyperthermia，radiation and chemotherapy：the role of heat in multidisciplinary cancer care［J］.Semin Oncol，2014，41（6）：714－29.

［2］邢旺興，陳斌，宓鶴鳴，等.烏骨藤辨考［J］.中藥材，2003，26（7）：524－526.

［3］左小東，崔永安，秦叔逵，等.烏骨藤制劑對人肝癌細胞株VEGF和bFGF表達的影響［J］.臨床腫瘤學雜志，2010，15（12）：1062－1065.

［4］張志強，韓富，謝海濤，等.烏骨藤對裸鼠膠質(zhì)瘤作用的實驗研究 ［J］.新中醫(yī)，2013，45（1）：160－161.

［5］聶麗華，沈婷，余波，等.烏骨藤多糖的提取及含量測定 ［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14（2）：167－168.

［6］倪峰，周春權，邱頌平，等.木姜子根多糖抗腫瘤作用研究 ［J］.中藥藥理與臨床，2003，19（3）：13－15.

［7］胡菁，敖明章，崔永明，等.甘草多糖的抗腫瘤活性及對免疫功能的影響［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20：911－913，

［8］Schijns V，Tartour E，Michalek J，et al.Immune adjuvants as critical guides directing immunity triggered by therapeutic cancer vaccines［J］.Cytotherapy，2014，16（4）：427－39.

［9］姜爽，李建睿，苑廣信，等.天南星多糖對荷瘤小鼠的抗腫瘤活性 ［J］.中國老年學雜志，2014，34（18）：5183－5184.

［10］沈明花，李巍，金梅花.小黃蘑多糖對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用研究［J］.中草藥，2013，44（17）：2433－2436.

Purification and Antitumor Activities of Polysaccharide from Caulis Marsdeniae Tenacissimae

FAN Danyi，CHANG Hong，JIANG Shaoyan，DENG Shaojie，HE Shan
Women and child health hospitial of Shenzhen in Guangdong province，Shenzhen Guangdong 518028

ObjectiveTo investigate antitumor activities and underlyingmechanisms of a water-soluble polysaccharide from Caulis Marsdeniae Tenacissimae.M ethods Marsdeniae Tenacissimae polysaccharides was intraperitoneal injection at three doses（100，200，400 mg／kg）to the S180 tumor bearingmice and antitumor effects，spleen index，thymus index，IL－2 and TNF－αlevelswere evaluated.Results Compared with model group，themedicated groups can significantly inhibit the growth of S180 tumor（P＜0.01），and meanwhile，spleen index，thymus index，IL－2 and TNF－αlevelswere significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Marsdeniae Tenacissimae polysaccharides has the antitumor activity and themechanism might be closely related to the optimizing immune response.

Marsdeniae Tenacissimae polysaccharides；antitumor；immune function

R285.5

A

1007－8517（2015）13－0012－02

2015.05.19）

國家自然科學地區(qū)基金項目（編號：81160492）資助。

譚麗萍 （1984－），女，云南西雙版納州人，實驗師。

陳文慧，云南中醫(yī)學院教授。