糖尿病大鼠腎臟XBP1的表達及普羅布考的干預研究

汪玉芹，劉麗秋，張 偉，王淑娟

（1.青島大學醫(yī)療集團莒縣人民醫(yī)院，山東莒縣276500；2.青島大學附屬醫(yī)院）

糖尿病大鼠腎臟XBP1的表達及普羅布考的干預研究

汪玉芹1，劉麗秋2＊，張 偉2，王淑娟2

（1.青島大學醫(yī)療集團莒縣人民醫(yī)院，山東莒縣276500；2.青島大學附屬醫(yī)院）

目的通過觀察糖尿病大鼠腎臟中X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的表達，評價腎臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，并通過觀察普羅布考對XBP1表達的影響，探討其腎臟保護作用。方法80只大鼠隨機分為健康對照組（C組n＝25）及造模組（n＝55），造模組給予鏈脲佐菌素（STZ）60mg／kg一次性腹腔注射構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型，將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組（D組n＝28），普羅布考組（P組n＝27）。P組給予普羅布考110mg／kg.d灌胃，D組及C組給予同體積蒸餾水灌胃。分別檢測4周，8周及12周24h尿蛋白，血清膽固醇、甘油三脂、尿素氮及肌酐。光鏡下觀察腎臟病理變化，免疫組化觀察腎組織XBP1的表達情況，western－blot測定XBP1的表達情況。結(jié)果C組24h尿蛋白、血清尿素氮、肌酐、甘油三酯及膽固醇4周，8周及12周均處于正常范圍，D組以上指標在4周、8周及12周逐漸升高，明顯高于同時間的C組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），P組以上指標亦逐漸升高，但明顯低于同時間的D組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C組大鼠腎臟在4周、8周及12周均顯示正常腎臟結(jié)構(gòu)，D組大鼠表現(xiàn)出明顯的節(jié)段性硬化等糖尿病腎病的病理改變，P組大鼠病理改變較D組明顯減輕；免疫組化顯示D組大鼠腎臟中XBP1的表達在4周、8周及12周逐漸升高，明顯高于同時間C組，P組大鼠腎臟中XBP1的表達較D組明顯減少，免疫組化積分均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；Westernblot結(jié)果與免疫組化相符。結(jié)論糖尿病大鼠腎臟中XBP1的表達增多，說明糖尿病大鼠腎臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平升高，普羅布考可以通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，下調(diào)XBP1的表達起到腎臟保護作用。

糖尿病腎病；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激XBP1普羅布考

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0190）

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生及進展中起著重要作用。氧化應(yīng)激的主要機制為自由基損傷及鈣超載，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的平衡中起重要作用。X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要活化轉(zhuǎn)錄因子，其表達量可反映細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平［1］。本實驗通過觀察糖尿病大鼠腎臟中XBP1的表達評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，進一步研究糖尿病腎病的發(fā)病機制，并通過觀察普羅布考對XBP1表達的影響，探討其腎臟保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

6－8周齡清潔級健康雄性wistar大鼠，體質(zhì)量為180－200g，購自山東魯抗實驗動物中心，兔抗大鼠XBP1抗體（美國abcam公司），STZ（美國sigma公司），血糖試紙（美國強生），普羅布考（齊魯制藥有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立與分組 80只6－8周齡體質(zhì)量為180－200g的雄性wistar清潔級大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為健康對照組（C組n＝25）及造模組（n＝55），STZ按照說明書配置，造模組禁食24h后一次性腹腔注射STZ60mg／kg構(gòu)建糖尿病大鼠模型。腹腔注射STZ72h后鼠尾靜脈測隨機血糖，血糖＞16.7mmol／L并能維持1周者為造模成功，造模成功的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組（D組n＝28））及普羅布考干預治療組（P組n＝27）。

1.2.2 治療及標本收集方法 P組大鼠給予普羅布考110mg／kg.d灌胃，D組和C組給予等體積的蒸餾水灌胃，分別于4周，8周，12周處死8只大鼠，處死前1天放入代謝籠留取24h尿，記錄24h尿量，－30℃冰箱凍存；水合氯醛3ml／kg腹腔注射麻醉后，內(nèi)眥靜脈取血，3 500r／min離心10min，留取血清，－80℃冰箱凍存；并于麻醉后開腹取雙腎，去除腎臟表面包膜，并將腎臟縱向剖開，取1／2左側(cè)腎臟固定于10%中性甲醛溶液中，其余腎組織放于液氮中凍存。

1.2.3 血、尿相關(guān)指標檢測 24h尿蛋白定量、甘油三酯、膽固醇、尿素氮及肌酐采用美國Beckcoulter DXC800全自動生化分析儀進行檢測。

1.2.4 腎臟病理 腎組織固定、切片（厚度2μm），HE染色，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學及結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.5 免疫組化測定XBP1的表達 二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫孵育10min（室溫），PBS浸洗5min，滴加抗原修復液室溫10min，PBS清洗3次，滴加封閉用山羊血清，室溫孵育10min，加入兔抗大鼠4－HNE抗體（1∶1 000），4攝氏度過夜，復溫10min，PBS沖洗2min×3次。滴加抗兔二抗，37℃孵育20min，PBS漂洗5min×3次。DAB顯色，蘇木素復染后封片觀察，應(yīng)用PBS代替一抗作陰性對照。以免疫組化染色積分反映4－HNE的表達水平［2］。

1.2.6 Western－blot測定XBP1的表達 取液氮保存后的腎組織，充分研磨、裂解、離心后，取上清液測定蛋白濃度，100℃加熱5min，取40μg／lane上樣后電泳，樣本用15%Tris－Glycine膠電泳分離蛋白后，電泳轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，以l×TBST洗滌后，與兔抗大鼠XBP1抗體（1∶ 500）4℃過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，應(yīng)用ECL檢測樣本的免疫活性，暗室曝光，X膠片顯影，應(yīng)用美國UVP分析儀器掃描膠片，得出灰度值，用同樣方法標記鼠單克隆抗體β－actin作為胞質(zhì)蛋白內(nèi)參對照。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，計量資料分析采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni檢驗，免疫組化染色積分采用非參數(shù)統(tǒng)計方法，顯著性水平設(shè)為P＜0.05，所有資料應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 生化指標C組尿素氮、肌酐、甘油三酯及膽固醇在4周、8周及12周均處于正常范圍，D組以上指標在4周、8周及12周逐漸升高，并明顯高于同時間的C組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），P組以上指標亦逐漸升高，但明顯低于同時間的D組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表1）

表1 各組大鼠不同時間生化指標比較（均數(shù)±標準差）

2.2 腎臟病理D組大鼠腎臟在8周時可見腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)增多，并可見節(jié)段性硬化，12周時以上病理改變更為明顯，節(jié)段性硬化進一步加重，并出現(xiàn)腎小球分葉，腎小囊腔不規(guī)則狹窄，并與腎小球粘連。P組大鼠腎臟以上病理改變較同時間的D組明顯減輕。C組表現(xiàn)為大致正常的腎臟結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟病理改變（HE染色×200）

2.3 免疫組化D組大鼠腎臟中XBP1主要表達在腎小管，并在4周、8周及12周表達逐漸升高，其免疫組化染色積分明顯高于同時間C組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），P組大鼠腎臟XBP1的表達亦逐漸升高，但其免疫組化染色積分明顯低于同時間D組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腎組織4－HNE免疫組化染色（×400）及柱形圖

2.4 Western－blot結(jié)果D組大鼠腎臟XBP1蛋白的表達逐漸升高，明顯高于同時間C組，差別有統(tǒng)計學意義，P組大鼠腎臟XBP1的表達在4周、8周、12周逐漸升高，但明顯低于同時間D組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠腎組織XBP1免疫印跡及相對表達量柱形圖

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由于未折疊的或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積所引起的，這一過程成為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。UPR可以觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間的信號轉(zhuǎn)導，從而抑制未折疊蛋白的合成，在一定程度上可以起到細胞保護作用，但過強的ESR可以誘導細胞的凋亡［3，4］。目前研究發(fā)現(xiàn)UPR主要由3中蛋白介導：I型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶（IRE－1）、轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）及雙聯(lián)RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）。未發(fā)生ESR的情況下，上述3種蛋白以無活性的形式與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GPR78）結(jié)合。在ESR情況下，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)與GRP78結(jié)合，激活I(lǐng)RE－1、ATF6及PERK，從而誘導UPR的過程［5］。

X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）是ESR的活化轉(zhuǎn)錄因子，XBP1mRNA含有26個不典型的內(nèi)含子，UPR可以激活I(lǐng)RE1，后者可以裂解XBP1mRNA，誘導XBP1的表達上調(diào)［6］。XBP1可以結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)元件（ERSE）及未折疊蛋白反應(yīng)元件（UPRE），上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶相關(guān)基因的表達，以幫助修飾、轉(zhuǎn)運或降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積的未折疊的蛋白質(zhì)，從而維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。XBP1的水平可以反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平［6］。此外，研究表明XBP1還可以維持細胞內(nèi)過氧化氫酶及超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化因子的水平；當ESR過強時XBP1還可以誘導caspase及CHOP等凋亡相關(guān)基因的表達，誘導細胞的凋亡［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)在，缺血再灌注的腦組織，缺血再灌注的肝臟中及肝癌患者的肝細胞中XBP1的表達明顯升高［6，8，9］。目前研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也參與了糖尿病腎病的發(fā)生及進展，但目前尚未見XBP1在糖尿病腎臟中的表達的相關(guān)報道。

本實驗觀察到STZ誘導的糖尿病大鼠在8周時出現(xiàn)典型的糖尿病腎病的病理改變，包括系膜基質(zhì)的增多，并可見節(jié)段性的硬化，腎小囊出現(xiàn)不規(guī)則的狹窄，腎小球在12周時可見分葉，且硬化更加明顯。XBP1在糖尿病大鼠的腎臟中的表達明顯升高，12周時表達量最高。其表達升高的可能機制如下：大量研究已經(jīng)證實糖尿病腎臟的氧化應(yīng)激水平明顯升高，活性氧產(chǎn)物（ROS）及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如4－HNE可以導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變［10］，使未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，并與GRP78結(jié)合，激活I(lǐng)RE1，后者可誘導XBP1的表達增多。

本實驗還觀察到應(yīng)用普羅布考干預治療的糖尿病大鼠腎臟中XBP1的表達明顯下降。目前研究發(fā)現(xiàn)普羅布考具有強大的抗氧化作用［11］，考慮其下調(diào)XBP1的機制為：普羅布考是含有酚羥基的斷鏈抗氧化劑，其強大的抗氧化能力可以消耗體內(nèi)的ROS，并可以降低脂質(zhì)過氧化的水平，使蛋白質(zhì)的折疊與轉(zhuǎn)運免受氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響，從而可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積的錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)，減輕UPR，從而下調(diào)XBP1的表達。

通過本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟中XBP1的表達增多，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的發(fā)生及進展，普羅布考可以通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平起到腎臟保護作用。

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Expression of XBP1 in the kidney of diabetic rats and the protective effect of probucol

WANG Yu－qin，LIU Li－qiu，ZHANG

Wei，et al.（People’s Hospital of Juxian，Qingdao 276500，China）

ObjectiveTo investigate the expression of 4－HNE in the kidney of diabetic rats and the protective effect of probucal.Methods80rats were randomly divided into three groups：control group（group C），diabetic group（group D）and probucol treated group（group P），group D and group P were giwen STZ（60mg／kg）by intraperitoneal injection to establish rat model of diabetic.After rat model of diabetic succesfully established，rats in group P were treated by probukol（110mg／kg.d），rats in group D and group C were given equal volume water insdead.SCr、BUN、TG、TC and urinary protein were measured at the 4th、8th and 12th weeks.HE staining were used to evaluate the pathological change of the kidney.The immunohistochemistry and Western－blot were used to detect the expression of XBP1in renal tissue.ResultsThe serum creatinine、BUN、TG、TC and 24－h(huán)our urinary protein in group D and grou P were increased in 4th、8th and 12th weeks，and were higher than those in group C（P＜0.05）.The pathological changes of the kidney in group D were more serious than group P.The expression of XBP1in group P was significantly lower than group D，（P＜0.05），but was much higher than group C（P＜0.05）.ConclusionThe XBP1expression siginificantly increases in the kidney of STZ induced diabetic rats，Probucol can protects the diabetic kidney through decreasing the expression of XBP1and the leval of endoplasmic reticulumStress.

Diabetic nephropathy；Endoplasmic reticulum stress XBP1Probucol

R589.1

A

2014－03－10）

1007－4287（2015）02－0190－04

＊通訊作者