紫檀芪對體外循環(huán)心肌缺血與再灌注損傷的保護(hù)作用

呂 民，李 哲，趙冬梅

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管外科，吉林長春130033）

紫檀芪對體外循環(huán)心肌缺血與再灌注損傷的保護(hù)作用

呂 民，李 哲，趙冬梅＊

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管外科，吉林長春130033）

目的研究紫檀芪在體外循環(huán)術(shù)中作為心臟冷停搏灌注液的添加劑使用，對抗體外循環(huán)術(shù)中心肌缺血、再灌注損傷的作用。方法采用2－3月齡的幼豬，體重10.4－11.5kg，30只，隨機(jī)分為三組，每組10只。組①為對照組，常規(guī)體外循環(huán)；組②常規(guī)體外循環(huán)，心臟冷停搏液中添加紫檀芪；組③常規(guī)體外循環(huán)，在心臟停跳前15min，靜脈輸入N＇－硝基－L－精氨酸甲酯鹽酸鹽（L－NAME），心臟冷停搏液中加入紫檀芪。測定三組動物血清肌酸磷酸激酶同工酶（CK－MB）水平及心肌組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，以及心肌組織腫瘤壞死因子α（TNF－α）水平，心肌組織的磷酸化的絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）P38的活性。計算心肌細(xì)胞線粒體平均比表面和面數(shù)密度。結(jié)果組①血清CK－MB、心肌MPO活性、心肌組織TNF－α水平、心肌組織的磷酸化P38MAPK的活性明顯高于組②（P＜0.01），與組③相近；線粒體形態(tài)計量分析，組①線粒體面數(shù)密度及比表面明顯低于組②（P＜0.01），組③略高于組①（p＞0.05），明顯低于組②（p＜0.01）。結(jié)論紫檀芪在體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)時作為心臟冷停搏液的添加劑使用，能減輕術(shù)中心肌炎癥反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性及穩(wěn)定性，保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)，對減輕術(shù)中心肌損害有明確的治療作用。

紫檀芪；缺血再灌注損傷；炎癥反應(yīng)

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0187）

體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)中，心肌保護(hù)方法及策略，一直是臨床心臟外科醫(yī)生的重要課題。紫檀芪（3，5－二甲氧基－4＇－羥基二苯乙烯）是一種天然存在的化合物，起初在藍(lán)莓及紫檀木中發(fā)現(xiàn)［1，2］。紫檀芪結(jié)構(gòu)類似于白藜蘆醇，白藜蘆醇在紅酒中被發(fā)現(xiàn)，具有抗氧化，抗炎，抗腫瘤作用。因為紫檀芪具有兩個甲基，這使其具有更高親脂性，從而獲得更高的生物利用度［35］。越來越多的證據(jù)顯示，紫檀芪在對諸如神經(jīng)、代謝、及血液疾病等多種人類疾病起著預(yù)防及治療作用［6］。進(jìn)一步實驗性研究表明，紫檀芪具有抗多種惡性腫瘤的作用［7］。我們在幼豬體外循環(huán)模型中，應(yīng)用紫檀芪作為心臟冷停搏灌注液的添加劑，觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，探討紫檀芪對體外循環(huán)術(shù)中心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 對象采用2－3月齡的雜種幼豬，體重10.4－11.5kg，30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，組間年齡、體重、心肌灌注量平均值差異無顯著性（P＞0.05）。

1.2 制劑藥品心臟冷停搏液組成為：0.9%生理鹽水500ml，10%氯化鉀7.5ml，5%碳酸氫鈉5 ml，25%硫酸鎂4ml，10%葡萄糖酸鈣10ml，2%利多卡因1.25ml。紫檀芪來自Sigma公司（美國）；MPO及CK－MB檢測試劑盒（南京生物工程研究所）；TNF－αElisa試劑盒購自安迪生物科技公司（美國）；L－NAME購自Sigma公司（美國）。

1.3 方法①按照我們前期實驗的方法建立體外循環(huán)［8］，轉(zhuǎn)機(jī)5min后，阻斷升主動脈，經(jīng)主動脈根部經(jīng)灌注針行心肌灌注，灌注心臟冷停搏液，每20 min重復(fù)灌注。升主動脈阻斷后30min，開放升主動脈，停止體外循環(huán)。對照組：主動脈阻斷時間30 min，心肌灌注量平均為480ml；Pte組：主動脈阻斷時間30min，心肌灌注量平均為500ml，在心肌冷停搏液中加入100μmol／L紫檀芪；Pte＋L－NAME組：主動脈阻斷時間30min，心肌灌注量平均為495 ml，在心臟停跳前15min，L－NAME1mmol／L靜脈輸入，心肌冷停搏液中加入紫檀芪濃度100μmol／L。②取材及標(biāo)本制備：于升主動脈開放后120 min，取靜脈血10ml，離心出血清，然后保存于－20℃冰箱中。按CK－MB檢測試劑盒操作，檢測血清CK－MB活性；取右心耳組織，按照MPO檢測試劑盒及TNF－αElisa試劑盒說明，檢測心肌MPO及TNF－α水平；采用改良蛋白印跡法（Western blots）檢測心肌磷酸化p38MAPK的活性；制作電鏡觀察標(biāo)本，心肌超微結(jié)構(gòu)觀察，行線粒體形態(tài)學(xué)分析：每組電鏡照片均應(yīng)用自動圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行線粒體形態(tài)計量分析［9］，計算線粒體平均比表面和面數(shù)密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法本實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較用方差分析，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié)果

血清CK－MB水平（u／g）、MPO水平（u／g）、TNF－α水平（pg／mg）及心肌磷酸化p38MAPK活性（光密度值）的比較見表1。Pte組與對照組、Pte＋L－NAME組相比血清CK－MB、MPO、TNF－α差異顯著（P＜0.01），對照組與Pte＋L－NAME組比較差異無顯著性（P＞0.05）。心肌線粒體面數(shù)密度和比表面結(jié)果見表2，Pte組明顯高于對照組和Pte＋L－NAME組（P＜0.01）；而對照組與Pte＋LNAME組無明顯差異（P＞0.05）。從以上實驗數(shù)據(jù)我們知道體外循環(huán)過程中，導(dǎo)致血清CK－MB水平、心肌髓過氧化物酶水平MPO、心肌組織TNF－α水平、心肌磷酸化p38MAPK活性升高，在心肌冷停搏液中加入紫檀芪，可以抑制如上指標(biāo)的升高，可以提高心肌線粒體面數(shù)密度和比表面。但紫檀芪的這種作用，可被L－NAME所拮抗。

表1 血清CK－MB、MPO、TNF－α水平及心肌磷酸化p38MAPK活性比較

表2 心肌線粒體面數(shù)密度和比表面

3 討論

研究表明，炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷過程中，起著重要作用［10］。p38MAPK在炎癥反應(yīng)中具有重要意義，是參與炎癥反應(yīng)過程中調(diào)控多種基因表達(dá)的重要因子，磷酸化激活后，由胞質(zhì)移入細(xì)胞核，調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)TNF－α、IL－6、IL－8等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。p38MAPK從炎性因子的產(chǎn)生、炎癥細(xì)胞趨化、黏附、血管通透性增加等多個環(huán)節(jié)調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

TNF－α主要由巨噬細(xì)胞分泌，是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，啟動由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［11］。TNF－α誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，提高粘附因子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。TNF－α具有負(fù)性肌力作用，抑制心肌收縮降低血壓。TNF－α也能誘導(dǎo)心肌纖維凋亡，參加心室肌重構(gòu)［12］。

如果抑制炎癥細(xì)胞及其相關(guān)因子的活性，可減低缺血再灌注損傷［13，14］。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志。MPO的主要功能是產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基在吞噬細(xì)胞內(nèi)殺滅微生物。MPO不僅能直接殺滅吞噬細(xì)胞內(nèi)的微生物，而且對機(jī)體調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮作用。

面數(shù)密度為單位參考系中的線粒體截面?zhèn)€數(shù)；比表面為某顆粒單位體積中的膜表面積。面數(shù)密度增大提示線粒體的數(shù)目增多，比表面增加說明線粒體單位體積內(nèi)具有的表面積增大，有利于其進(jìn)行物質(zhì)交換。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)能單位，也是對缺氧最敏感的細(xì)胞器，線粒體的變化是評定心肌保護(hù)效果的重要指標(biāo)［15］。內(nèi)皮細(xì)胞源性的NO抑制中性粒細(xì)胞粘附及內(nèi)向膜遷移［16］，也能抑制TNF－α及其他炎癥因子的表達(dá)。N＇－硝基－L－精氨酸甲酯鹽酸鹽（LNAME），一種NO合成酶抑制劑。在本實驗中，提前靜脈給予L－NAME，可抵消紫檀芪的抗炎癥，及心肌保護(hù)作用。

本實驗表明，紫檀芪作為體外循環(huán)術(shù)中心肌灌注液的添加劑使用，能抑制磷酸化P38MAPK的活性，抑制TNF－α的表達(dá)，抑制MPO的表達(dá)水平，抑制了由缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而達(dá)到了心肌保護(hù)的作用。從本實驗可以推斷出，紫檀芪抑制炎癥反應(yīng)是通過提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO的產(chǎn)生水平來實現(xiàn)的。在臨床上，也為體外循環(huán)心肌保護(hù)提供了一個潛在的新的方法。

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Protective effects of pterostilbene on myocardial ischemic reperfusion injury in cardiopulrnonary bypass

LV Min，LI

Zhe，ZHAO Dong－mei.（Department of Cardiovascular surgery，China－Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveTo study the effects of pterostilbene on alleviating myocardial ischemia and preventing the reperfusion injury when it was applied as the additive of the perfusion liquid in the process of cardiac surgery with cardiopulrnonary bypass（CPB）.MethodsPiglets the age of 2－3months and weighs 10.4－11.5kg were randomly divided into three group.Control group，the cardiopulrnonary bypass alone.The pte group，pterostilbene was added to the perfusion liquid solution.The pte+L－NAME group，pterostilbene was added to the perfusion liquid solution，and LNAME.iv.15minutes prior to heart arrest.The activity of serum CK－MB，MPO，P38MAPK and levels of TNF－αwere determined in all kinds of groups.The changes of myocardial ultrastuctures were observed under eIectron microscope.ResultsThe level of CK－MB，MPO，TNF－α，P38MAPK was significantly increased in the control group than that in the Pte group（P＜0.01），the control group was similar to The pte+L－NAME group.The result of mitochondria morphological measurement indicated that the mitochondrial face number density and specific surface were significantIy lower in the control group than those in the Pte group（P＜0.01），the control group was similar to the pte+L－NAME group.Conclusionpterostilbene acted as the additive of the the cold stopping－pulse solution could attenuate inflammatory reaction and protect the myocardial membrane and the ultrastructure of myocardium and debate the damage in the cardioectomy.

Pterostilbene；reperfusion injury；inflammatory reaction

R654.1

：A

呂民（1969－），男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事心肺保護(hù)方面的研究。

2014－10－15）

1007－4287（2015）02－0187－03

吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項目（2013C028－5）

＊通訊作者