利多卡因后處理對家兔心肌缺血-再灌注損傷TNF-α NF-κB表達的影響*

王 友 朱蘇紅 王建禮 林 娜 王保生

(濟寧醫(yī)學院基礎學院，山東 濟寧，272067)

利多卡因后處理對家兔心肌缺血-再灌注損傷TNF-α NF-κB表達的影響*

王 友 朱蘇紅 王建禮 林 娜 王保生

(濟寧醫(yī)學院基礎學院，山東 濟寧，272067)

目的 研究家兔心肌缺血-再灌注損傷時，利多卡因后處理對其體內TNF-α水平及NF-κB表達的影響。方法 18只家兔隨機分為假手術組、缺血-再灌注組和利多卡因組3組。結扎家兔心臟的左室支40min后解除結扎，恢復血液供應，再灌注2h后測定各組家兔血漿TNF-α的水平，通過免疫組化染色和免疫印跡方法觀察心肌NF-κB的表達情況。結果 與缺血-再灌注組比較，利多卡因組再灌注后血漿TNF-α濃度明顯降低，心肌細胞NF-κB的表達顯著減少。結論 利多卡因可以抑制再灌注心肌炎癥反應，減輕損傷。

利多卡因；后處理；心肌缺血-再灌注損傷；NF-κB；TNF-α

在我國，缺血性心臟病已成為死亡的首要原因，在缺血性心臟病的防治中，經皮腔內冠狀動脈成形術、心臟動脈搭橋術及心臟移植等治療技術廣泛的開展使缺血性心臟病得到了有效的防治，可是術后心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的發(fā)病率在逐年增高，減輕MIRI已成為缺血性心臟病治療的重要環(huán)節(jié)。本文旨在探討在體情況下，利多卡因后處理對家兔心肌缺血-再灌注時炎性損傷的抑制作用，進而減輕MIRI，為臨床MIRI的防治提供新的手段。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗選用健康的新西蘭白兔(本校實驗動物中心提供)18只，雄性，體重2.5～3.0kg；家兔TNF-α ELISA檢測試劑盒(R&D 美國)；NF-kB抗體(武漢博士德)；全自動酶標分析儀(MK3 Thermo，美國)。

1.2 動物的分組及處理

將18只家兔隨機分成缺血-再灌注組(IR組)、利多卡因組(L組)和假手術組(sham 組)。各組處理方式如下：1) IR組：家兔全身麻醉后，于頸部甲狀軟骨至胸骨上行正中切口，分離氣管后行氣管插管術連接動物呼吸機(30ml，45次/min)；家兔四肢皮下插入針性電極，實時監(jiān)測心電圖(Ⅱ導聯)；沿家兔胸骨左緣處縱行切開皮膚(2～5肋)，將肌肉逐層結扎切開分離，暴露肋軟骨，仔細分離肋間肌肉，暴露第3、4肋骨，剪斷肋骨暴露胸腔。小心剪開心包，暴露心臟，以左心耳到心尖連線的中點為結扎點，使用帶線縫合針(6-0)結扎左室支，其上放置一段硅膠管(長15mm，直徑5mm)，結扎硅膠管，阻斷左室支血流，以心電圖示ST段明顯上抬，作為左室支結扎成功、心肌發(fā)生缺血的標準。心肌缺血40 min后，耳緣靜脈注射生理鹽水(0.5ml/kg)后剪去結扎線，以心電圖ST段回落，表明心肌灌注恢復，再灌注120 min后終止實驗。2)L組：手術處理與IR組相同，再灌注前耳緣靜脈注射利多卡因(5mg/kg，10mg/ml)，再灌注120min終止實驗；3)sham組：手術處理與IR組相同，但只穿線，不結扎，于40min時耳緣靜脈注射生理鹽水(0.5ml/kg)，120min后終止實驗。

1.3 血漿中TNF-α水平測定

各組家兔再灌注120min后，于頸總動脈放血2ml，置于離心管中，離心15min(3000r/min，4℃)后取上清，置于-20℃凍存?zhèn)溆?。使用家兔TNF-αELISA檢測試劑盒檢測血漿TNF-α水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 心肌組織中NF-κB的檢測

各組家兔再灌注120min后，從左室支結扎點以下橫切留取心肌標本，厚度約為0.4cm，置于4%多聚甲醛溶液固定；留取心尖組織約1g，-80℃凍存?zhèn)溆?。固定的心肌組織標本進行石蠟包埋，制成約5μm厚切片行免疫組織化學染色。留取的心尖組織剪碎，加入蛋白裂解液，使用勻漿機勻漿，冰上靜置30min，離心30min(12000g，4℃),取上清。BCA法測定蛋白質濃度，取80μg進行SDS-PAGE (10%)電泳，Western blot分析NF-κB的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 各組家兔血漿TNF-α的水平比較

再灌注120min后，sham組、IR組、L組家兔血漿TNF-α水平分別為(68.2±5.1)、(95.3±9)、(80.3±2.4)，后兩組TNF-α水平明顯高于sham組(P<0.05)，且IR組血漿TNF-α水平高于L組(P<0.05)。(見圖1)。

與假手術組比較* P<0.01；與缺血-再灌注組比較# P<0.01

2.2 家兔心肌組織中NF-κB的表達

免疫組化染色可見，sham組(圖2A)家兔心肌細胞排列正常，無水腫、出血等，除血管內皮細胞有微弱NF-κB表達，其余部位基本不表達。IR組(圖2B)心肌細胞斷裂明顯，有大量的單核細胞浸潤，損傷嚴重，細胞內NF-κB呈強陽性(棕黃色)表達。L組(圖2C)心肌細胞損傷較輕，細胞內陽性表達較弱。Western blot檢測，以GAPDH校準后蛋白條帶的IOD值表示心肌組織NF-κB表達的變化。與sham組NF-κB表達量(0.45±0.018)相比，IR組(0.73±0.015)和L組(0.5±0.023)NF-κB表達分別增加61%，13%，與IR組比較，L組表達低29%。見圖3。

A：假手術組；B：缺血-再灌注組；C：利多卡因組

圖2 利多卡因后處理對心肌缺血-再灌注家兔心肌組織NF-κB(p50)表達的影響(HE×400)

與假手術組比較*P<0.01；與缺血-再灌注組比較#P<0.01

3 討論

MIRI臨床主要表現為心肌舒縮功能降低、心律失常及心肌頓抑等，如何有效的改善MIRI已成為臨床上治療缺血性心肌病的重要課題。1986年，Murry[1]首次提出了缺血預處理的概念，即缺血前，反復幾次的短暫的“缺血￣再灌注”循環(huán)處理可以減輕缺血-再灌注損傷，但是缺血預處理在臨床上的可操作性不強。2003年，Zhao[2]等發(fā)現缺血后處理的方法可有效減輕缺血-再灌注損傷，這為臨床上防治缺血-再灌注損傷提供了更具操作性的措施，現已證實缺血后處理和多種藥物后處理的方法均可有效減輕缺血-再灌注損傷。心肌缺血-再灌注時，血管內皮細胞、白細胞等被激活，生成、釋放大量的炎性因子，介導組織細胞的炎性損傷是MIRI的主要發(fā)生機制。TNF-α是體內重要的炎性因子，可以刺激中性粒細胞激活，促進血管內皮細胞表達黏附分子，使中性粒細胞在缺血心肌組織中聚集，釋放蛋白水解酶和活性氧等物質，加重心肌組織損傷[3]。本文結果顯示，MIRI時，機體血漿中TNF-α的表達明顯增加，利多卡因后處理可明顯的減少TNF-α的表達，減輕炎性損傷。

NF-κB參與MIRI的病理生理過程，NF-κB活化后移位入核可能是急性炎癥發(fā)生發(fā)展的最早啟動的關鍵環(huán)節(jié)。NF-κB活化會促進多種炎癥介質、黏附分子如ICAM-1等基因的表達[4]。本文結果顯示缺血-再灌注組和利多卡因組心肌細胞在缺血再灌注時，NF-κB表達均增加，且與TNF-α的表達呈正相關，表明利多卡因后處理可使心肌NF-κB的表達減少，進而減少炎癥因子TNF-α的表達，減輕MIRI。

利多卡因在臨床上多作為局麻藥和抗心律失常藥使用，近年來研究發(fā)現，利多卡因對多種炎性因子有抑制作用，且已在各種疾病模型中得到證實，其抗炎作用甚至超過了傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥[5]。本實驗前期研究表明，利多卡因可以有效地減輕家兔心肌缺血-再灌注后的炎性損傷[6]，本文結果顯示利多卡因后處理可減少心肌細胞NF-κB的表達及炎性介質TNF-α的表達，減輕心肌炎性損傷，對于缺血-再灌注心臟有一定的保護作用。

[1] Murry C E,Jennings R B,Reimer K A， et al.Preconditioning with ischemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986，74(5):1124-1136.

[2] Zhao Z Q,Corvem J S,Halkos M E,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic post-conditioning during reperfusion:comparison with ischemic pre-conditioning[J].Am J Physiol 2003,285(2):579-588.

[3] Balkwill F,Joffroy C.TNF:a tumor-suppressing factor or a tumor-promoting factor?[J].Future Oncol，2010,6(12):1833-1836.

[4] Nichols T C.NF-kappaB and reperfusion injury[J].Drug News Perspect，2004，17(2):99-104.

[5] Azuma Y,Shinohara M,Wang P L,et al.Comparison of inhibitory effects of local anesthetics on immune functions of neutrophils[J].Int J Immunopharmacol,2000，22(10):789-796.

[6] 王友,王保生,林麗文，等.利多卡因減輕家兔心肌缺血-再灌注炎性損傷的研究[J].濟寧醫(yī)學院學報,2012,35(2):100-103.

The effect of lidocaine post-treatment on TNF-α and NF-κB in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury

WANGYou,ZHUSuhong,WANGJianli,LINNa,WANGBaosheng

(School of Basic Sciences,Jining Medical University,Jining 272067,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of lidocaine post-treatment on TNF-α and NF-κB in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury.MethodsEighteen rabbits were randomly divided into 3 groups，sham operation group,ischemic reperfusion group and lidocaine group.The left ventricular branch (LVB) of rabbits was ligated for 40minutes,then the ligation was removed.Afer 120 minutes the level of plasma TNF-α was measured,meanwhile the degree of NF-κB was detected with immumohistochemical staining and Western blot.ResultsCompared with those of ischemic reperfusion group,the concentration of TNF-αwas decreased in lidocaine group (P<0.01).The expression of NF-κB was inhibited by lidocaine too.ConclusionThe results demonstrated that lidocaine could protect cardiac function,inhibit inflammatory response and attenuate reperfusion injury in ischemic heart.

Lidocaine；Post-treatment；Myocardial ischemia reperfusion;NF-κB；TNF-α

* [基金項目]2008年濟寧醫(yī)學院青年基金資助項目

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.05.004

R363.2

A

1000-9760(2015)10-318-03

2015-08-17)