地黃內(nèi)生菌的分離鑒定及其抑菌活性測定

★ 元輝明 朱金華 馬廣強（江西中醫(yī)藥大學生命科學學院 南昌330004）

地黃內(nèi)生菌的分離鑒定及其抑菌活性測定

★ 元輝明 朱金華 馬廣強*（江西中醫(yī)藥大學生命科學學院 南昌330004）

對河南焦作產(chǎn)鮮地黃的內(nèi)生菌進行分離、純化，對其形態(tài)學、生化、16S rDNA序列進行分析及抑菌活性進行測定，初步了解該菌的相關特性并為其資源的開發(fā)利用提供參考。方法：對鮮地黃用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，用劃線法進行分離與純化，然后用革蘭氏染色、生化管、16S rDNA序列分析鑒定、藥敏試紙抑菌實驗對內(nèi)生菌及其抑菌性進行鑒定。結(jié)果：篩選得到的鑒定菌在革蘭氏染色及鏡檢后鑒定顯示1號、2號和3號菌均為梭狀細菌，4號為桿狀細菌；生化管實驗的顏色變化顯示1號、2號和3號菌為梭菌屬細菌，4號菌為土壤農(nóng)桿菌；16S rDNA的鑒定結(jié)果表明3號菌為蘇云金芽孢桿菌,3號菌對三種病原微生物的抑菌作用不明顯。結(jié)論：地黃中分離純化得到的3號菌的抑菌活性不顯著。

內(nèi)生菌；分離純化；革蘭氏染色鑒定；生化管鑒定；PCR

內(nèi)生菌是指一類在其部分或其全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。關于內(nèi)生菌的藥用活性成分，我國學者對一些傳統(tǒng)藥用植物的內(nèi)生菌進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了許多藥用活性成分,有些內(nèi)生菌在非藥用植物體內(nèi)也可以產(chǎn)生一些對病原菌有拮抗作用的活性成分。通過對鮮地黃（Rehmannia glutinosa）的內(nèi)生菌的分離純化，研究某類內(nèi)生菌的抑菌性，從而了解該類菌與地黃的互惠共生關系，對該類菌進行分離與純化，其代謝產(chǎn)物的藥性研究對地黃的產(chǎn)量具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料:

1.1.1 實驗樣品 河南焦作鮮地黃

1.1.2 實驗藥品 營養(yǎng)瓊脂；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；營養(yǎng)肉湯；生理鹽水；結(jié)晶紫溶液；盧戈氏碘液；95%的酒精溶液；復紅溶液；腸桿菌科細菌生化鑒定管；3種病原菌（大腸桿菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌）；瓊脂糖；TAE；EB替代染料；細菌基因組提取試劑盒；溶菌酶；m ix；上、下游引物；M arker等。

1.1.3 實驗儀器：電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）,高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申有限公司）,隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）,凝膠成像系統(tǒng)（Fluorchem M）等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制與滅菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基：稱取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基粉末6.2g用蒸餾水配制成200m l培養(yǎng)液；高壓蒸汽滅菌后分裝到培養(yǎng)皿中。

營養(yǎng)瓊脂：稱取營養(yǎng)瓊脂粉末9.0g用蒸餾水配制成200m l；培養(yǎng)液高壓蒸汽滅菌后分裝到培養(yǎng)皿中。

營養(yǎng)肉湯：稱取營養(yǎng)肉湯粉末3.6g用蒸餾水配制成200m l培養(yǎng)液。

生理鹽水：將配置好的0.9%的生理鹽水分裝成10支（9m L/支）。

1.2.2 地黃內(nèi)生菌的培養(yǎng)與分離純化 地黃內(nèi)生菌的培養(yǎng)：取一塊河南焦作原產(chǎn)地地黃，先用蒸餾水水洗干凈，然后去超凈工作臺操作。先點燃酒精燈，然后將刀片在酒精燈火焰上過幾下，確保刀片無菌，然后用刀片將地黃表皮切除，將已去表皮的地黃切取四小塊，將這四個地黃切塊置于盛有75%的酒精的燒杯中，兩分鐘后取出，用三蒸水沖洗四次后，置于干凈燒杯中。取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基各一個，用鑷子在酒精燈上烤幾下，然后各自夾取兩塊地黃切片均勻放于兩個培養(yǎng)基中。最后將兩個培養(yǎng)基放于30℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。

內(nèi)生菌的分離與純化：取有特殊形態(tài)的菌落，用三線法劃線分離細菌后于30℃恒溫箱中培養(yǎng)48h以獲得單菌落。

1.2.3 地黃內(nèi)生菌的液體培養(yǎng) 將純化的1號、2號、3號和4號內(nèi)生菌接種至裝有營養(yǎng)肉湯的試管中進行液體培養(yǎng)，放于37℃液體搖床中進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。

1.2.4 地黃內(nèi)生菌的平板涂布計數(shù) 地黃切片：取一塊地黃，先用蒸餾水沖洗干凈，在無菌操作條件下，用小刀將表皮切除，然后切成小片，再于電子天平上稱取1克地黃切片。將此切片于75%的酒精中浸泡一分鐘后，再用三蒸水沖洗四次，沖洗干凈后。再在無菌條件下，把此切片放于已滅菌的研缽中，用移液槍向研缽中加入5mL生理鹽水，然后進行研磨，再用移液槍吸取2mL于一滅菌的試管中，并用記號筆標記為0，即為原液。另外再用移液槍吸取1mL原液備用，用于原液DNA提取，用于后面的實驗，并標記為原液--DNA。

原液梯度稀釋：將三管9mL的三蒸水排列好，按10-1、10-2和10-3依次編號。在無菌操作條件下，用1mL無菌移液槍吸取1mL原液于裝有9mL三蒸水并標有10-1的試管中，將移液槍吹洗三次，搖勻即為10-1濃度菌液。1mL移液槍更換槍頭后，用同樣方法，制成10-2和10-3濃度的菌液。

平板涂布與培養(yǎng)：將已經(jīng)準備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基若干個放于超凈工作臺上，點燃酒精燈，用1mL移液槍在已剩有1mL原液的試管中吸盡1mL原液，然后在酒精燈旁操作，將此1mL原液打入一個玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中，再用已滅菌了的涂布棒桿勻菌液，最后用記號筆在此培養(yǎng)基平板上標記1號。用同樣方法將10-1、10-2和10-3梯度的菌液吸取1mL后涂布于培養(yǎng)基上并標記為2號、3號和4號。最后將這四個平板放到30℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。

1.2.5 革蘭氏染色法 革蘭氏染色鑒定細菌的顯微形態(tài)。

1.2.6 生化微量鑒定管鑒定 常用的生化鑒定管對細菌進行生化鑒定。

1.2.7 PCR實驗

1.2.7.1 試劑盒方法提取細菌總D N A。

1.2.7.2 PCR反應 用取菌DNA 4μL，再加入10μL mix和上、下引物各3μL，制成20μL的PCR反應體系。然后將裝有20μL的PCR反應體系的離心管放進PCR儀。在PCR儀設置程序，一個循環(huán)：95℃（30 s），55℃（30 s），72℃（1.5 min）。如此循環(huán)30次。

1.2.7.3 PCR產(chǎn)物電泳鑒定 配制成1%的瓊脂糖溶液；每孔加入2μL PCR產(chǎn)物；80 V電泳25min，用紫外透視儀觀察擴增條帶，與Maker長度對照，若條帶與引物設計時的擴增條帶相符，PCR產(chǎn)物則送往生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.8 抑菌實驗

1.2.8.1 病原菌平板劃線涂布 大腸桿菌、結(jié)核桿菌和金黃色葡萄球菌涂布整個平板后倒置平板。

1.2.8.2 藥敏試紙 取浸泡內(nèi)生菌細菌培養(yǎng)液的藥敏紙片均勻粘貼到涂布病原菌的固體培養(yǎng)基上，37度，培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

圖1 地黃內(nèi)生菌的分離純化。

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

表1 生化微量鑒定管鑒定結(jié)果表

2.1 地黃內(nèi)生菌的培養(yǎng) 共分離到四株懷地黃植物內(nèi)生菌，見如圖1。

2.2 革蘭氏染色及顯微觀察結(jié)果 見圖2，其中1號、2號、3號菌為革蘭氏陽性菌，4號菌為革蘭氏陰性菌。1號、2號、3號菌呈梭狀，有鞭毛，芽孢橢圓或球形孢囊膨大；4號菌呈桿狀，有鞭毛，無莢膜。

2.3 生化微量鑒定管鑒定 見表1。由實驗結(jié)果可以得出的是四種菌生化反應各異，參照伯杰氏細菌鑒定手冊知道1號、2號和3號菌是梭菌屬，且3號菌為蘇云金芽孢桿菌，4號菌為枯草芽孢桿菌。

圖3 PCR擴增產(chǎn)物

2.4 16S rDNA產(chǎn)物電泳結(jié)果的分析和測序結(jié)果的序列對比分析。

2.4.1 16S rDNA產(chǎn)物電泳結(jié)果的分析 見圖3。由實驗結(jié)果可以知道從3號菌的D N A與從地黃切片制成的原液中的D N A擴增的目的基因片段大小相似。（其中marker為5000bp）

2.4.2 測序結(jié)果的序列對比分析 經(jīng)生物公司測序后獲得的3號菌的PCR產(chǎn)物擴增片段，在進入N C B I公司的軟件序列對比分析獲得了進化樹信息，見圖4。

圖4 進化樹分析3號菌16S rDNA序列

經(jīng)進化樹圖分析后可知3號菌為梭菌屬且為蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）。2.5對病原細菌抑菌實驗結(jié)果 見表2。結(jié)果可以知3號菌對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌作用較明顯，較可能會分泌一些抗菌物質(zhì)以抑制金黃色葡萄球菌的生長。

表2 3號菌對病原菌抑菌效果

3 討論

國內(nèi)外有很多應用經(jīng)典方法如細菌的菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化特性、代謝產(chǎn)物等對細菌進行鑒定的研究，但這些傳統(tǒng)的方法鑒定微生物耗時耗力，而且培養(yǎng)條件的改變可能會導致結(jié)果發(fā)生變化，即鑒定結(jié)果很不穩(wěn)定。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，包括熒光定量P C R技術(shù)在內(nèi)的一批新技術(shù)的應用，使得微生物學的研究擺脫了傳統(tǒng)依靠純培養(yǎng)分離鑒定的束縛，使快速、全面、準確地反映微生物多樣性成為可能。然而雖然現(xiàn)代技術(shù)更快、更好、更精確，但也不保證在鑒定過程中失誤。因此在本次實驗研究中，我采用了傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合的鑒定方法，以使實驗結(jié)果更準確與可靠。

目前，對許多內(nèi)生菌產(chǎn)的活性物質(zhì)研究不完全清楚，難以得到較為純凈的有效成份。這也影響了內(nèi)生茵的實際應用。但從長遠角度看，內(nèi)生菌的研究會給內(nèi)生菌的應用帶來新的契機，必將給人類的生活帶來更大的利益，具有重要和廣闊的開發(fā)應用前景。

［1］Li Wan-Kui，HU Zhi-Bi．Endophytes and Natural Medicines[M]．Institute of Materia Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，2012.

［2］WU L，HAN T，LIW，et a1．Geographic and tissue influences on endophytic fungal communities of Taxus chinensis var．mairei in China[J]．CurrentMi-crobiology，2013，66（1）：40-48．

Isolation,Identification and Antibacterial Activities of Endophytes in Fresh Rehmannia

YUAN Hui-m ing,ZHU Jin-hua,MA Guang-qiang
JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China.

Objective:Endophytes of henan jiaozuo fresh Rehmannia get endophytes separation,purification,and then on themorphology,biochemistry,16S rDNA identification and the determination of antibacterial activity,preliminary understanding the characteristics of the bacteria and provide data for the development and utilization of its resources.Methods:the fresh Rehmannia nourished with nutrient AGAR culturemedium and rosy sodium,by exploringmethod for separation and purification,and then using gram staining, biochemical tube,PCR and drug susceptibility test paper bacteriostatic experiment of endophytes and their antibacterial sex identification.Results:the identification of bacteria in screening for gram staining and microscopy after identification showed no.1,2 and 3 were fusiform bacteria,4 for rod-shaped bacteria;Biochemical tube experiments showed the color change of the no.1,2 and 3 bacteria for Clostridium bacteria,4 bacteria for soil Agrobacterium;16S rDNA identification results showed that the 3 bacteria for bacteria and fusobacterium thuringiensis bacillus;And 3 isolates on the bacteriostatic action of three kinds of pathogenicmicroorganismswere not obvious.Conclusion:No.3 bacteria's antibacterial activity are not significant.

endophytic bacteria;Separation and purification;Gram staining appraisal;Biochemical identification;PCR

R285.5

A

2014-05-30）編輯：曾文雪

*通信作者：馬廣強（1977-），男，副教授。研究方向：微生物與免疫學。T el:18770050616,E-m a il:m a g u a n g q i a n g@163.co m。