中藥對(duì)去勢(shì)小鼠生殖系統(tǒng)及行為學(xué)的影響

★ 郭文宇 劉燦燦 董藝丹 張小旭 張秀文 孫鳳芹 王逸舒 夏雷（山東中醫(yī)藥大學(xué) 濟(jì)南 250355）

中藥對(duì)去勢(shì)小鼠生殖系統(tǒng)及行為學(xué)的影響

★ 郭文宇 劉燦燦 董藝丹 張小旭 張秀文 孫鳳芹 王逸舒 夏雷*（山東中醫(yī)藥大學(xué) 濟(jì)南 250355）

目的：觀察中藥熟地、丹參對(duì)去勢(shì)小鼠子宮及行為學(xué)的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)更年期綜合征的干預(yù)作用。方法：將40只昆明種雌性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、熟地組、丹參組，每組10只,除正常組外，其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)模擬雌激素缺乏引起的更年期綜合征。通過(guò)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察中藥對(duì)去勢(shì)小鼠行為學(xué)的影響，通過(guò)子宮系數(shù)、病理形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化法觀察中藥對(duì)去勢(shì)小鼠子宮發(fā)育的影響。結(jié)果：與正常組相比，模型組子宮系數(shù)、內(nèi)膜厚度及血管密度明顯減少（P<0.05）。熟地組、丹參組可改善子宮系數(shù)及內(nèi)膜厚度，其中熟地組內(nèi)膜間質(zhì)增生較明顯，丹參組血管增生較明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：熟地、丹參具有類雌激素樣作用。去勢(shì)小鼠可較好的模擬更年期綜合征的臨床表現(xiàn)，熟地、丹參對(duì)其癥狀具有一定的緩解作用，但其機(jī)制可能不同。其中，對(duì)子宮內(nèi)膜的影響熟地可促進(jìn)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，丹參可誘導(dǎo)血管的生成。

熟地；丹參；更年期綜合征

更年期綜合征（climacteric syndrome,CS）是指更年期婦女因卵巢功能逐漸衰退或喪失，以至雌激素水平下降所引起的機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)、免疫功能低下和自主神經(jīng)功能紊亂的癥候群。傳統(tǒng)的激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）可緩解或治療更年期綜合征，但長(zhǎng)期應(yīng)用有可能誘發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等。因此，人們開(kāi)始尋找雌激素的替代物。其中植物雌激素的生理效果是較為注目的研究焦點(diǎn)[1]。中醫(yī)藥對(duì)該病的治療早已有之，其中又以活血化瘀藥和補(bǔ)益藥占有較大比例。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察熟地、丹參對(duì)去勢(shì)小鼠子宮及行為學(xué)的影響，初步探討雌激素缺乏與更年期綜合征發(fā)生的關(guān)系，并觀察中藥在治療更年期綜合征中的作用機(jī)制和效果，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 動(dòng)物 健康成年雌性昆明種小白鼠40只,體重20～38g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料由魯抗生物科技有限公司提供，合格證號(hào)：scxk魯20130001。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器 分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，JA5003N）；電熱干燥箱（中國(guó)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，CS101-1DS）；切片機(jī)（上海徠卡公司，RM2015）；恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；顯微鏡（美國(guó)AO公司）。

1.3 試劑與藥物 水合氯醛（國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，T20080911）；青霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，B131206）；熟地、丹參（山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院提供）；CD34免疫組化盒（博士德生物工程有限公司，09C12B）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制作 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、熟地組、丹參組。除正常組外，其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，俯臥固定，于最末肋骨下、腋中線上約距脊柱2cm處剪毛，用酒精常規(guī)消毒局部皮膚，切開(kāi)皮膚和背肌，可見(jiàn)一乳白色發(fā)亮脂肪團(tuán)（卵巢包埋其中），以小鑷子輕夾脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)后，可見(jiàn)到粉紅色的卵巢，摘取卵巢；術(shù)后將子宮角送回腹腔，縫合肌肉和皮膚。同法摘取另一側(cè)卵巢。術(shù)后第5d逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，觀察各組小鼠陰道脫落細(xì)胞角化指數(shù)（CD）的變化，每日1次，連續(xù)5次。以不出現(xiàn)動(dòng)情期反應(yīng)為造模成功[2]。

2.2 熟地、丹參水煎濃縮液制備及給藥方式 取熟地、丹參各100g，分別加水800mL，浸泡30min，煎煮30min,過(guò)濾。藥渣加水400mL,煎煮20min,過(guò)濾。合并兩次煎液,濃縮至100mL,所得熟地、丹參水煎濃縮液的濃度為1g/mL,放入4℃冰箱中貯存,備用。熟地組和丹參組小鼠分別進(jìn)行灌胃給藥。正常組和模型組灌胃生理鹽水。灌胃給藥前將水煎濃縮液溫?zé)帷Ｃ恐幻刻旃辔?.1mL,連續(xù)灌胃21d。

2.3 強(qiáng)迫游泳 給藥1周后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳,將小鼠置于25cm玻璃缸,水深15cm,水溫20℃左右,每次1只。連續(xù)觀察6min,記錄后4min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（即漂浮水面、停止掙扎、僅仰頭呼吸,或偶爾撲動(dòng)上肢以保持平衡）[3]。每天1次,連續(xù)14天。取最后兩次不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.4 小鼠處死及子宮分離 末次給藥24h后,小鼠頭頸部位脫臼處死動(dòng)物,電子天平稱量體重。立即分離子宮，剔除子宮表面脂肪等雜物,分析天平稱量子宮濕重,放入4%甲醛水溶液中固定。計(jì)算子宮系數(shù)（即：子宮濕重/體重×100%）。小鼠子宮經(jīng)固定后,用常規(guī)梯度乙醇脫水,經(jīng)二甲苯透明后,用65℃低熔點(diǎn)石蠟包埋。切片機(jī)切片,制備石蠟切片,切片厚度為4～5μm。常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化后,使用蘇木素、伊紅染色,中性樹(shù)脂封片,鏡下觀察并拍照。

2.5 免疫組化及毛細(xì)血管密度檢測(cè) 將子宮切片置電熱干燥箱中30m in,控制溫度60℃。常規(guī)脫蠟至水,抗原熱修復(fù),消除過(guò)氧化物酶活性,BSA封閉,滴加CD34抗體（一抗）、生物素標(biāo)記二抗、酶標(biāo)鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液,D A B顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)脂封片,鏡下觀察并拍照。以細(xì)胞質(zhì)膜呈棕黃色為陽(yáng)性。用Image-plus6.0分析軟件進(jìn)行分析,測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值及新生毛細(xì)血管情況。計(jì)數(shù)方法:每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野，計(jì)算4個(gè)視野內(nèi)毛細(xì)血管平均數(shù)。毛細(xì)血管判斷標(biāo)準(zhǔn)為：染成棕黃色的數(shù)個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成的竇狀、條索狀管腔或無(wú)管腔結(jié)構(gòu)的數(shù)個(gè)或單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞[4]。

3 結(jié)果與分析

3.1 子宮系數(shù) 與正常組相比,模型組子宮系數(shù)明顯降低。與模型組相比，熟地組和丹參組子宮系數(shù)升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠子宮系數(shù)(±s)

表1 各組小鼠子宮系數(shù)(±s)

注：與正常組比較,?P＜0.05。

組別 n 子宮重量/ g 子宮系數(shù)/ %正常組模型組熟地組丹參組9 8 9 7 0 . 0 5 7 ± 0 . 0 2 3 0 . 0 2 2 ± 0 . 0 1 7*0 . 0 2 6 ± 0 . 0 2 5 0 . 0 2 6 ± 0 . 0 2 1 2 . 0 4 ± 0 . 6 4 0 . 6 9 ± 0 . 4 9 0 . 8 6 ± 0 . 9 0 1 . 0 4 ± 0 . 8 4

3.2 強(qiáng)迫游泳與正常組相比,模型組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。熟地組、丹參組與模型組相比，不動(dòng)時(shí)間略微縮短,但仍比正常組要長(zhǎng),見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠毛細(xì)血管密度及強(qiáng)迫游泳結(jié)果(±s)

表2 各組小鼠毛細(xì)血管密度及強(qiáng)迫游泳結(jié)果(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別正常組模型組熟地組丹參組n 9 8 9 7毛細(xì)血管密度/ m m2不動(dòng)時(shí)間/ s 1 9 6 . 4 5 ± 2 1 . 3 0 9 7 . 2 2 ± 2 6 . 5 0 1 0 2 . 1 4 ± 3 1 . 2 3 1 5 2 . 4 0 ± 2 5 . 3 1△3 9 . 5 9 ± 3 8 . 1 1 5 2 . 4 8 ± 4 0 . 2 4 7 . 8 5 ± 4 0 . 2 1 4 8 . 5 6 ± 3 9 . 6 3

3.3 HE染色 正常子宮內(nèi)膜：子宮內(nèi)膜增生良好,子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)發(fā)育同步，腺上皮細(xì)胞呈低柱狀,局部可見(jiàn)假?gòu)?fù)層排列,可見(jiàn)微絨毛,有核下空泡出現(xiàn),細(xì)胞核呈空泡狀,腺腔輕度擴(kuò)張,可見(jiàn)粉紅色分泌物；間質(zhì)輕度水腫，部分標(biāo)本呈蛻膜化改變,部分標(biāo)本仍呈增殖期改變,可見(jiàn)血管擴(kuò)張;子宮肌層發(fā)育良好,見(jiàn)圖1-A。

模型組子宮內(nèi)膜：子宮內(nèi)膜發(fā)育不良,內(nèi)膜及肌層與正常組相比明顯變薄腺上皮細(xì)胞呈立方型,細(xì)胞核深染,染色質(zhì)濃集,無(wú)明顯空泡性變化,腺腔無(wú)明顯擴(kuò)張,無(wú)明顯分泌物,間質(zhì)無(wú)明顯水腫、疏松改變，血管數(shù)量較少,無(wú)明顯擴(kuò)張,見(jiàn)圖1-B。

熟地組子宮內(nèi)膜：子宮內(nèi)膜厚度正常，但與正常組相比，腺體數(shù)量明顯減少，腺上皮細(xì)胞呈立方型及低柱狀排列，可見(jiàn)少量空泡化改變，腺腔無(wú)明顯擴(kuò)張，無(wú)明顯分泌物，間質(zhì)增生較明顯，間質(zhì)疏松，可見(jiàn)輕度水腫，血管數(shù)量增加，并伴有明顯擴(kuò)張；肌層無(wú)明顯萎縮，見(jiàn)圖1-C。

丹參組子宮內(nèi)膜：子宮內(nèi)膜發(fā)育正常，腺體數(shù)量與模型組相比明顯增多，腺上皮細(xì)胞呈低柱狀，腺腔無(wú)明顯擴(kuò)張，可見(jiàn)少量粉紅色分泌物，部分間質(zhì)呈蛻膜化改變、疏松、水腫，內(nèi)膜及肌層血管數(shù)量較豐富，可見(jiàn)明顯擴(kuò)張，見(jiàn)圖1-D。

3.3 免疫組化 免疫組化顯示，與正常組相比，模型組子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯減少。與模型組相比，熟地組子宮內(nèi)膜血管有少量增生，丹參組內(nèi)膜增生較明顯，但仍低于正常組，見(jiàn)表2、圖2A-D。

4 討論

圖1 -A正常對(duì)照組

圖1 -B模型組

圖1 -C熟地組

圖1 -D丹參組

更年期綜合征是婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病,現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響中老年婦女生活質(zhì)量的主要疾患之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,其主要病機(jī)是腎虛；西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其核心病機(jī)是卵巢功能衰退，雌激素水平下降。中、西醫(yī)在病因病機(jī)上的認(rèn)識(shí)是統(tǒng)一的。激素替代療法（HRT）是西醫(yī)防治更年期綜合征的主要方法。但同時(shí)帶來(lái)了不良后果，如子宮內(nèi)膜增生、生殖系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌等[5,6]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，植物雌激素對(duì)更年期綜合征有一定治療和預(yù)防作用，且不良反應(yīng)少。目前，對(duì)植物雌激素的研究和開(kāi)發(fā)利用是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

熟地為治療婦科病的良藥。古人云：“大黃附子為藥中良將，人參熟地為藥中良相?！比鐙D人良方“四物湯”中即重用熟地以治療婦人血虛之頭暈乏力、心悸怔仲、失眠、月經(jīng)失調(diào)、崩漏等癥。

丹參具有活血通經(jīng)、涼血消腫、祛癰腫丹毒之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參對(duì)冠心病、肝炎、肝硬化等疾病的治療效果顯著。同時(shí)，在治療婦科疾病方面，丹參也有重要作用。早在五代時(shí)期，《日華子本草》明確指出，丹參可“安生胎，落死胎，止血崩、帶下，調(diào)婦人經(jīng)脈不勻”。至明朝，隨著“一味丹參散，功同四物湯”的廣泛流傳，丹參遂成為婦科圣藥，在婦科、產(chǎn)科得到廣泛應(yīng)用[7]。

圖2 -A正常組

圖2 -B模型組

圖2 -C熟地組

圖2 -D丹參組

本實(shí)驗(yàn)選用卵巢摘除小鼠（又稱去勢(shì)小鼠）模型來(lái)模擬CS。因?yàn)榕源萍に?0%由卵巢分泌,摘除卵巢,切斷其來(lái)源,人為地造成雌激素突然降低的環(huán)境,可模擬CS。此模型比較經(jīng)典,造模時(shí)間短,模型成功率高[3]。

使用子宮增重法檢測(cè)藥物的雌激素活性是常用的評(píng)價(jià)雌激素作用的方法之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組子宮系數(shù)明顯減少，高劑量熟地、丹參組子宮系數(shù)與模型組相比雖然有增加，但增加不明顯（P>0.05），且與正常組相比仍然降低，說(shuō)明熟地、丹參雖然具有一定的類雌激素樣作用，但其活性較弱；可對(duì)更年期綜合征產(chǎn)生一定的干預(yù)作用。通過(guò)病理形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化法觀察，可知其作用機(jī)制有所不同：熟地在誘導(dǎo)子宮增生中的作用主要是促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞及血管的生長(zhǎng)，對(duì)腺體生長(zhǎng)的誘導(dǎo)作用較弱；而丹參不僅僅是誘導(dǎo)子宮間質(zhì)及血管生長(zhǎng)，對(duì)腺體的發(fā)育也有明顯的促進(jìn)作用。中藥藥效的發(fā)揮都是通過(guò)有效成分實(shí)現(xiàn)的。丹參的活性成分包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅲ、紫參酮甲素等，具有類雌激素樣作用。但目前對(duì)熟地的研究較少，熟地的類雌激素樣作用是通過(guò)哪種或哪些有效成分實(shí)現(xiàn)的，仍需進(jìn)一步探索。從中醫(yī)藥的角度，熟地以補(bǔ)血為主，丹參以活血為主。本實(shí)驗(yàn)顯示，熟地、丹參均可促進(jìn)子宮內(nèi)膜及肌層血管生長(zhǎng)，其中丹參在促進(jìn)血管生長(zhǎng)方面的作用更明顯。究竟其差異在活血、止血中藥中普遍存在，還是由于兩種藥物中類雌激素成分不同引起的，也需要我們進(jìn)一步去研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察兩味中藥對(duì)去勢(shì)小鼠行為學(xué)的影響。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)壳霸谝钟舭Y的研究中被廣泛使用，不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，越具有絕望狀態(tài)，能有效、定量地判定抑郁程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種結(jié)果可能是由于小鼠個(gè)體差異較大所引起的，也可能是由于雌激素缺乏。雖然雌激素缺乏可以影響到精神狀態(tài)，但抑郁癥的發(fā)生還受其他因素影響，單純雌激素缺乏并不必然導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。雌激素缺乏與抑郁癥發(fā)生的關(guān)系還需進(jìn)一步探討。熟地、丹參可減少不動(dòng)時(shí)間，提示在治療更年期心理異常，如更年期出現(xiàn)的情感障礙、情緒低落等方面可以發(fā)揮作用。

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Effect of Chinese M edicine on the Reproductive System and the Behavior of Castrated Rats

GUO Wen-yu,LIU Can-can,DONG Yi-dan,ZHANG Xiao-xu,ZHANG Xiu-wen,SUN Feng-qin,WANG Yi-shu,XIA Lei
Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China.

Objective:To observe effects of Radix Rehmanniae Preparata and Salvia on the uterus and behavior of ovariectomized rats to evaluate interventional the effects on Climacteric Syndrome.Methods:Forty Kunming female rats were randomly divided into normal group,model group,Radix Rehmanniae Preparata group and Salviae group,with 10 rats in each group.Bilateral oophorectomy was performed to simulate Climacteric Syndrome induced.Through the forced swimming test to observe the effect of castration on behaviors ofmice,Pathomorphological observation and immunohistochemicalmethod to ovserve the effect of traditional Chinesemedicine on ovariectomized mice uterus.Result:Compared with the normal group,the uterus coefficient,the endometrial thickness and the endometrial vascular density decreased significantly in themodel group（P<0.05）.It is indicated that themodelwas built successfully. The uterus coefficient and the endometrial thickness were improved in the Radix Rehmanniae Preparata group and the Salviae group. In Radix Rehmanniae Preparata group,endometrial stromal hyperplasia was obvious,while in Salviae group,endometrial Vessels hyperplasia was obvious and statistical significance was obtained（P<0.05）.Compared with the normal group,immobility time was prolonged in themodel group and was improved in the Radix Rehmanniae Preparata group and the Salviae group.However,all of them had no statistical significance.Conclusion:Radix Rehmanniae Preparata and Salvia have estrogen-like activities.The ovariectomized mice can simulate Clinical Manifestation of Climacteric Syndrome quite well.Radix Rehmanniae Preparata and Salvia can relieve clinical symptom of Climacteric Syndrome,however theirmechanismsmay be different.Radix Rehmanniae Preparata can promote the growth of endometrial stromal cells,while Salvia can induce the growth of endometrial Vessels.

Radix Rehmanniae Preparata;Salvia;Climacteric Syndrome

R285.5

A

2014-06-23）編輯：萬(wàn)崇毅

*通信作者：夏雷。