趙 晴,婁 巖,李 丹,付 瑜,孫 燦,孔 娟*
維生素D受體對急性肝臟損傷保護(hù)作用的研究
趙 晴1,婁 巖2,李 丹3,付 瑜1,孫 燦1,孔 娟1*
目的 探討維生素D受體在內(nèi)毒素感染時對肝臟的保護(hù)作用。方法 隨機抽取C57 BL/6源性的野生小鼠10只和維生素D受體(VDR)敲除小鼠10只,分為對照組和實驗組,實驗組LPS 15 mg/kg腹腔注射。應(yīng)用免疫組化及免疫熒光法、實時定量PCR法等方法測定小鼠血漿中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量、細(xì)胞因子及進(jìn)行PAI-1在肝臟組織中的定量分析。結(jié)果 注射LPS后,VDR敲除鼠肝臟中的巨噬細(xì)胞陽性染色明顯多于對照組。VDR敲除組血漿AST水平明顯高于對照組。在基因敲除鼠肝臟中傷害性細(xì)胞因子IL-2、IL-18、IL-12、IFN-γ明顯升高,而保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10明顯降低。PAI-1在VDR敲除鼠的肝臟中表達(dá)明顯增多。結(jié)論 VDR在內(nèi)毒素對肝臟損傷時能夠起到保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究維生素D及其信號系統(tǒng)的功能提供了理論依據(jù)。
維生素D;內(nèi)毒素;細(xì)胞因子;纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)
維生素D是核受體家族的一員,通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)下位基因的作用[1]。VDR廣泛存在于各種組織和器官中,與活化的1,25(OH)維生素D結(jié)合,調(diào)節(jié)下游信號系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),VitD具有廣泛的生理功能,除調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷平衡外,近十幾年研究發(fā)現(xiàn),維生素D通過其受體不僅調(diào)控脂肪細(xì)胞的發(fā)生[2]、脂代謝[3]、糖代謝[4]、免疫系統(tǒng)[5],還通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)對心血管[6]、腎、腦以及動物的行為等功能進(jìn)行調(diào)控,并影響神經(jīng)、生殖、內(nèi)分泌、上皮及毛發(fā)生長等,故有學(xué)者認(rèn)為維生素D是一種激素而不是維生素,稱之為VitD內(nèi)分泌系統(tǒng)。1,25(OH)維生素D3通過刺激巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用,可以幫助免疫反應(yīng)的啟動[7]。維生素D缺乏已被證實與修復(fù)免疫反應(yīng)有關(guān),能降低白細(xì)胞的趨化作用和增加感染機會。
本研究應(yīng)用VDR敲除鼠和野生鼠的比較,探討維生素D在內(nèi)毒素對肝臟損傷時的保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究維生素D及其信號系統(tǒng)的功能提供理論依據(jù)。
1.1 實驗動物及處理方法 C57 BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只,2月齡,體重20~25 g,性別不限,室溫飼養(yǎng),飼料為普通動物飼料,自由飲水進(jìn)食。隨機分為對照組、實驗組各10只,對照組用同容積生理鹽水,實驗組用LPS 15 mg/kg腹腔注射。
1.2 免疫組化及免疫熒光法 肝臟組織用配制的10%福爾馬林(pH=7.2)固定、石蠟包埋,切片(4 μm/片);常規(guī)復(fù)水后,孵育一抗過夜;沖洗后孵育二抗室溫1 h,DAB染色,或直接室溫孵育熒光二抗1 h;脫水封片;用熒光顯微鏡進(jìn)行顯微照相。特異性抗巨噬細(xì)胞抗體購自Santa Cruz公司,貨號:MAC387。
1.3 實時定量PCR法測定小鼠肝臟中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 將小鼠組織提取后,用TRizol法按照試劑說明書提取總RNA,用美國Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。細(xì)胞因子的引物設(shè)計使用Primer 3.0設(shè)計合成特異性引物mB2M-2,atttcaatgtgaggcgggtggaac,mB2M-1,accggcctgtatgctatccagaaa,mIL1b-1,ccaaaagatgaaggggtgctgct,mIL1b-2,acagaggatgggctcttctt,mTNFa-1,cagaccctcacactcagatca,mTNFa-2,aacctgggagtagacaaggt,mIL12p35-1,gtgaagacggccagagaaaa,mIL12p35-2,agctccctcttgttgtggaa,mTrpc6-1,cctccctaatgaaaccagca,mTrpc6-2,gattgccagcattccaaagt,IL-18P1,aagcttcagaacacaatacataagcc,IL-18P2,gcaggcagcacaccacagg,IL10-1,ataatgcacccacttccca,IL-2,gggcatcacttctaccaggt,IL6-1,cctctggtcttctggagtacc,IL6-2,actccttctgtgactccagc。
1.4 Northern法檢測PAI-1基因的表達(dá) 用PCR法克隆一段cDNA片段,克隆進(jìn)入PSK質(zhì)粒中,經(jīng)常規(guī)擴增后,雙內(nèi)切酶法產(chǎn)生PAI-1探針,凝膠電泳mRNA后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上,用P32標(biāo)記探針雜交轉(zhuǎn)印到X光片上,表達(dá)的數(shù)值用Image J.軟件分析。
1.5 血漿AST含量測定 經(jīng)心臟取血,抗凝離心后取上清,檢測血漿中AST含量,用Sigma公司試劑盒貨號Catalog Number MAK055,按說明操作。
2.1 免疫組化法結(jié)果 經(jīng)內(nèi)毒素15 mg/kg腹腔注射6 h后的野生鼠和VDR敲除鼠帶有巨噬細(xì)胞特異性抗moma抗體的肝臟切片的免疫染色顯示,在VDR敲除鼠肝臟中的巨噬細(xì)胞陽性染色明顯多于對照組,見圖1。由圖1可見,內(nèi)毒素注射6 h后,VDR敲除鼠肝臟中開始出現(xiàn)巨噬細(xì)胞增多,肝細(xì)胞損傷逐漸顯現(xiàn)。
圖1 免疫組化法結(jié)果
2.2 血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶含量測定 兩組小鼠接受LPS 15 mg/kg腹腔注射后18 h,野生型對照組和注射組相比,血漿中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而注射LPS的VDR敲除組血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。表明維生素D受體敲除后,LPS嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞,見圖2。
圖2 血漿中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量測定
2.3 細(xì)胞因子水平的變化 經(jīng)內(nèi)毒素腹腔注射18 h后,野生型鼠和基因敲除鼠肝臟組織中細(xì)胞因子的變化可見,在基因敲除鼠肝臟中傷害性細(xì)胞因子IL-2、IL-18、IL-12、IFN-γ明顯升高,而保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10明顯降低,見圖3a、圖3b。肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞因子的增多代表肝細(xì)胞受損嚴(yán)重。
2.4 PAI-1檢測 應(yīng)用Northern試驗方法檢測PAI-1在肝臟經(jīng)LPS處理后8 h和16 h的表達(dá),并用Image j.軟件定量,可見在注射LPS 8 h以后,VDR敲除鼠的表達(dá)增加,16 h表達(dá)仍然高于野生鼠。PAI-1的升高標(biāo)志著肝細(xì)胞凝血功能受損,進(jìn)一步證明內(nèi)毒素處理后的肝臟在VDR敲除鼠中受損嚴(yán)重。見圖4a、圖4b。
圖3a 內(nèi)毒素腹腔注射18 h后,野生型鼠和基因敲除鼠肝臟組織中細(xì)胞因子比較
圖3b 內(nèi)毒素注射6 h和18 h后,野生鼠和維生素D受體(VDR)敲除鼠肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞因子比較
研究表明,內(nèi)毒素可損傷肝細(xì)胞膜,干擾肝細(xì)胞線粒體能量代謝過程[8-9],誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[10]。內(nèi)毒素可能主要通過免疫細(xì)胞-炎性介質(zhì)介導(dǎo)肝組織損傷。在體內(nèi)內(nèi)毒素首先激活Kupffer細(xì)胞,最終激活Kupffer細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),刺激細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)的合成與釋放,包括TNF-α、白介素、白三烯B4和補體C5,趨化循環(huán)中的中性粒細(xì)胞[11]。
圖4a PAI-1在肝臟經(jīng)LPS處理后8 h和16 h的定量
圖4b Northern PAI-1表達(dá)法的定量數(shù)值
這些被激活的中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基,引起脂質(zhì)過氧化作用破壞肝細(xì)胞,釋放谷丙轉(zhuǎn)氨酶。
本研究結(jié)果表明,在內(nèi)毒素行腹腔注射6 h后,用巨噬細(xì)胞特異性抗體染色的巨噬細(xì)胞數(shù)量在VDR敲除鼠的肝臟中明顯增多(圖1),這些增多的巨噬細(xì)胞可能由于LPS的趨化作用來自于血液循環(huán)中的單核細(xì)胞,也可能是局部肝臟中的Kupffer 細(xì)胞,因為LPS腹腔注射后,經(jīng)腹腔中的腸系膜、大小網(wǎng)膜吸收入血進(jìn)入腸系膜靜脈,到達(dá)肝臟,首先對肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用(圖2)。正如圖2中所示,在野生型鼠體內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量在注射15 mg/kg LPS后沒有明顯升高,而VDR敲除鼠體內(nèi)AST的含量有將近10倍的增加,表明此劑量還沒有達(dá)到使野生型鼠肝臟受損的劑量,而缺乏VDR鼠的肝臟在極低的劑量下,肝細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞,谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放入血,血中含量明顯升高,說明有保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷的作用。IL-10 為體內(nèi)重要的抗炎性細(xì)胞因子,通過抑制Th1細(xì)胞的增殖和IL-2、IFN、白三烯等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而抑制Th1型免疫應(yīng)答,降低患者的細(xì)胞免疫功能,促進(jìn)Treg的增殖和活化,從而有利于誘導(dǎo)機體對外來病原的耐受。IL-6是一種由巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的多能單鏈黏蛋白細(xì)胞因子,在正常情況下可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,參與炎癥反應(yīng)和在抗感染防御中起重要作用,而在病理狀態(tài)下,過度的升高可造成機體的病理性損傷。IL-18 是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子,主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞Th1 細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等分泌,又能促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖和Th1型免疫應(yīng)答,促進(jìn)TNF-α、NO、GH-CSF等炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生。同時該因子為一種最為強烈的TNF-α誘導(dǎo)因子,而TNF-α又通過正反饋通路刺激單核-巨噬細(xì)胞大量分泌IL-18,加速炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生,造成細(xì)胞免疫介導(dǎo)的組織炎癥性損傷[12]。大量LPS入血雖然可產(chǎn)生直接的毒性作用,但大部分有害作用是由于Mφ受LPS刺激后釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),本研究結(jié)果表明,維生素D敲除鼠肝臟中的傷害性細(xì)胞因子明顯高于野生型,而保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10明顯低于野生型。研究表明,肝臟組織中的細(xì)胞因子絕大多數(shù)由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。如果前幾種細(xì)胞因子分泌過多,在肝臟局部會產(chǎn)生破壞肝組織細(xì)胞的作用。PAI-1是生理上抑制纖溶酶原激活的抑制劑,是體內(nèi)最重要的纖溶活性調(diào)節(jié)因子,與多種血栓性和出血性疾病密切相關(guān)[13]。本研究中PAI-1在維生素D敲除鼠肝組織中表達(dá)增加。從圖4的結(jié)果看來,在內(nèi)毒素行腹腔注射8 h后,維生素D敲除鼠肝臟內(nèi)PAI-1的表達(dá)明顯高于野生鼠,16 h PAI-1在維生素D敲除鼠肝臟中的表達(dá)仍然明顯增多。表明PAI-1可能參與了LPS對肝臟的損傷作用。PAI-1在肝臟組織中表達(dá)的升高進(jìn)一步標(biāo)志著維生素D敲除鼠肝臟細(xì)胞受損的數(shù)目增多,從另一方面證明維生素D受體及其信號系統(tǒng)有保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷的作用。本研究應(yīng)用LPS經(jīng)腹腔注射后,研究肝臟中細(xì)胞因子和PAI-1表達(dá)在維生素D受體敲除鼠和野生鼠體中的變化,因野生鼠中維生素D受體健全,肝細(xì)胞受損輕微,而維生素D受體敲除鼠在實驗中表現(xiàn)出肝酶升高,炎癥性細(xì)胞因子增多,凝血受損,肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重,表明兩者差異在維生素D受體上,證明了維生素D受體在內(nèi)毒素對肝臟損傷時的重要保護(hù)作用,從而進(jìn)一步證明了維生素D受體及其信號系統(tǒng)在傷害性刺激時具有保護(hù)肝功能的作用。
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Protective effect of Vitamin D receptor on acute hepatic injury
ZHAO Qing1,LOU Yan2,LI Dan3,FU Yu1,SUN Can1,KONG Juan1*
(1.Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.Department of Computer,China Medical University,Shenyang 110013,China;3.Physical Examination Center,463 Hospital of Chinese PLA,Shenyang 110042,China)
Objective To explore the protective effect of Vitamin D receptor on hepatic injury induced by LPS.Methods The C57 BL/6 mice were randomly divided into control group and experimental group from 10 wild and 10 Vitamin D receptor(VDR)knockout mice respectively.LPS 15 mg/kg i.p.was injected into experimental group.Plasma AST of mice,the change of cytokines and PAI-1 quantity in liver tissue were determined by immunofluorescence,real-time PCR methods.Results Marked accumulation of macrophages were more in the liver of VDR knockout mice after LPS-treated than those in control group.Plasma AST in VDR knockout mice was significantly higher than that in control group.Nocuous cytokines IL-2,IL-18,IL-12,IFN-γ were significantly higher,and protective cytokine IL-10 was significantly lower in the liver of VDR knockout mice than those in control group.PAI-1 was significantly higher in the liver of VDR knockout mice.Conclusion Vitamin D receptor can play a protective role on hepatic injury induced by LPS,which provides a theoretical evidence for further study of Vitamin D and the function of its signal function.
Vitamin D;LPS;Cytokines;PAI-1
2014-09-12
1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營養(yǎng)科,沈陽 110004;2.中國醫(yī)科大學(xué)計算機教研室,沈陽 110013;3.沈陽市軍區(qū)463醫(yī)院體檢科,沈陽 110042
國家自然科學(xué)基金(30971401、81170065);遼寧省攀登學(xué)者計劃;遼寧省十百千計劃
10.14053/j.cnki.ppcr.201501006
*通信作者