新型腫瘤靶向藥物TMTP1-DKK應用于宮頸癌治療的初步研究

魏 睿，李 飛，張振中，程 騰，奚 玲

·論著·

新型腫瘤靶向藥物TMTP1-DKK應用于宮頸癌治療的初步研究

魏 睿，李 飛，張振中，程 騰，奚 玲*

目的 探討TMTP1-DKK在治療高轉(zhuǎn)移宮頸癌的潛在應用價值。方法 選擇高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移配對宮頸癌細胞系SiHa和C-33A，Transwell試驗分別確證其轉(zhuǎn)移能力；Rhodamine標記TMTP1，免疫熒光檢測Rhodamine-TMTP1對SiHa、C-33A的親和能力；CCK8檢測TMTP1-DKK和TMTP1-VK處理后對SiHa和C-33A細胞的殺傷率，Transewell檢測TMTP1-DKK和TMTP1-VK處理后對SiHa細胞侵襲能力的影響。結(jié)果 SiHa細胞侵襲能力強于C-33A，TMTP1親和實驗顯示TMTP1對高轉(zhuǎn)移細胞系SiHa親和力明顯高于C-33A,TMTP1-DKK對SiHa生存率影響明顯強于C-33A，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 TMTP1-DKK能特異性地殺傷高侵襲能力的宮頸癌細胞SiHa，但對低轉(zhuǎn)移能力細胞C-33A殺傷效應不明顯。提示TMTP1-DKK可以作為高轉(zhuǎn)移宮頸癌靶向化療藥物的可能性。

TMTP1；宮頸癌；腫瘤轉(zhuǎn)移；靶向治療

0 引言

腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移是腫瘤患者手術(shù)治療后導致患者生存率和生活質(zhì)量下降的重要因素之一。癌癥患者中的 70%經(jīng)手術(shù)治療、放療和化療后是有效的，但是其中治療后的一部分患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移。而微小病灶轉(zhuǎn)移用傳統(tǒng)方法例如細致的臨床體格檢查，病理檢查，生物化學以及放射性診療手段很難發(fā)現(xiàn)，這些都會導致腫瘤患者的復發(fā)。腫瘤復發(fā)患者5年生存率不到50%，盡管現(xiàn)在有很多新型的治療方法問世，但是發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移患者的5年生存率并沒有顯著提高。宮頸癌治療后復發(fā)或者未控率為29%～38%，復發(fā)是該病的主要死因，包括局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[1]。近年來，腫瘤靶向治療發(fā)展迅速，備受人們的重視，包括小分子抑制劑、單克隆抗體和小分子多肽[2]。TMTP1是華中科技大學附屬同濟醫(yī)院腫瘤分子生物醫(yī)學中心通過細菌鞭毛肽庫技術(shù)篩選得到的，具有分子量小、易于合成、細胞穿透能力強和無免疫原性等優(yōu)點，該肽能特異性結(jié)合高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞，包括前列腺癌、乳腺癌、胃癌、耐藥卵巢癌，但是對低轉(zhuǎn)移細胞系和正常細胞無作用[3-5]。它可以作為靶向治療的分子載體，攜帶小分子毒性藥物靶向?qū)鼓[瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶。研究發(fā)現(xiàn)，抗微生物活性肽D(KLAKLAK)2與靶向線粒體啟動凋亡的多肽CNGRC相偶聯(lián)后，可增強抗腫瘤的效應[6]。該多肽D(KLAKLAK)2與促凋亡的抗微生物肽結(jié)構(gòu)相似,并且在真核細胞外保持相對的無毒性,與其他的靶向肽相偶聯(lián)后，可誘導線粒體腫脹，促進細胞的凋亡。本研究將TMTP1和D(KLAKLAK)2偶聯(lián)到一起命名為TMTP1-DKK,將對照肽為錯構(gòu)肽和D(KLAKLAK)2偶聯(lián)一起命名為TMTP1-VK，選用2種宮頸癌細胞系SiHa和C-33A，檢測TMTP1-DKK在治療宮頸癌方面的可能性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 全波段酶標儀(美國Bio-tek公司)；相差顯微鏡(日本Olympus公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Termo公司)。試劑：FITC-TMTP1-DKK(西安華辰公司)；FITC-TMTP1-VK(西安華辰公司);CCK-8(日本Dojindo公司);SiHa宮頸癌細胞系(美國ATCC公司)；C-33a宮頸癌細胞系(美國ATCC公司)；Transewell小室(美國Corning公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(中國四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物預處理 人宮頸癌細胞系C-33A和SiHa置于DMEM完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基)中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合率達90%時進行胰蛋白酶消化，傳代或種于孔板，細胞爬片上進行下一步實驗。按照藥物處理和實驗目的分為實驗組NK和對照組VK。

1.2.2 體外侵襲實驗 將4 ℃放置的液態(tài)的Matrigel膠鋪置在Transwell小室的下層，務必無氣泡，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱30 min；將消化成單細胞懸液的對照組和處理組C-33A和SiHa細胞4 000個，以120 μL含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基的體積種于Transwell上層小室中，下層中加入400 μL 20%FBS的3T3上清。繼續(xù)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用棉簽輕擦去未穿過的細胞后，用PBS洗3遍，再用4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗3遍后，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3遍。使用正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來，可清楚地看到小室底膜上下室附著的細胞，隨即選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)。

1.2.3 TMTP1對SiHa和C-33A細胞親和能力 將胰酶消化過的SiHa和C-33A單細胞懸液調(diào)整密度后，分別種于24孔板中的爬片上，十字搖勻37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待密度達到50%時，加入含3 μmol的Rhodamine-TMTP1，避光下37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱2 h，PBS洗3遍后，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍后，加入細胞核染液(DAPI)室溫染色8 min，PBS洗3遍后，放置爬片于載玻片上，加入抗免疫熒光淬滅劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 CCK8法測TMTP1-DKK和TMTP1-VK對宮頸癌細胞系SiHa和C-33A細胞系增殖抑制試驗 將胰酶消化過的SiHa和C-33A單細胞懸液在調(diào)整密度后，以每孔100 μL體積，5 000個細胞接種于96孔板，邊緣用無菌PBS添空，貼壁24 h后，更換培養(yǎng)基，每孔加入含有5、10、20、40、80 μM的TPMTP1-DKK和TMPT1-VK的DMEM培養(yǎng)基100 μL，搖勻，每組濃度設3個副孔，并設無多肽無細胞的對照組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h后，加入37 ℃預熱的Cell counting kit-8(Dojindo,日本)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標儀450 nm處讀取吸光度值。計算生長抑制率(IR)=[(對照組-實驗組)/對照孔]×100%。實驗重復3次。

2 實驗結(jié)果

2.1 體外侵襲實驗 4 000個沒有處理的SiHa和C-33A細胞分別種植在Transewell小室，24 h后通過隨機選取5個視野計數(shù)，結(jié)果表明，在相同條件下宮頸癌細胞系SiHa具有較強的侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1-A、圖1-B。

2.2 TMTP1對SiHa和C-33A細胞親和能力實驗 3 μM Rhodamine-TMTP1分別作用于宮頸癌細胞SiHa和C-33A，3 h后細胞爬片在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照示：TMTP1作用于SiHa細胞后顯示較強的紅色熒光，而C-33a相對較弱。即TMTP1對SiHa細胞相對于C-33a有較好的親和性。見圖1-C。

圖1 TMTP1對不同侵襲能力的宮頸癌細胞SiHa和C-33A的親和性

2.3 CCK8法測TMTP1-DKK和TMTP1-VK對宮頸癌細胞系SiHa和C-33A細胞系增殖抑制試驗 使用濃度分別為5、10、20、40、80 μM的TMTP1-DKK和TMTP1-VK作用于SiHa和C-33A細胞24 h，通過CKK-8檢測TMTP1-DKK對SiHa和C-33A增殖影響，發(fā)現(xiàn)TMTP1-DKK和TMTP1-VK在5、10、20 μM濃度時，對SiHa和C-33A的殺傷無差異性，在濃度為40、60、80 μM時，TMTP1-DKK對SiHa有抑制增殖作用(P<0.05)，TMTP1-VK對SiHa殺傷無差異性，TMTP1-DKK和TMTP1-VK對C-33A增殖無抑制作用。見圖2。

圖2 TMTP1-DKK和TMTP1-VK對宮頸癌細胞SiHa和C-33A增殖的影響

2.4 TMTP1-DKK抑制SiHa體外侵襲遷移能力實驗 選取對SiHa無增殖抑制的低濃度10 M TMTP1-DKK和TMTP1-VK處理后的細胞種植在Transwell小室，24 h后通過隨機選取5個視野計數(shù)，結(jié)果表明，該濃度下TMTP1-DKK明顯抑制SiHa細胞的體外侵襲能力，TMTP1-VK基本無影響，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

目前，分子靶向治療已成為惡性腫瘤的治療手段之一，針對腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移通路、抑制血管淋巴管生成等特異靶點進行治療的一種全新的治療模式已被用于臨床[7-8]。最近發(fā)現(xiàn)一些新型多肽能夠特異性地穿透腫瘤細胞以及腫瘤細胞相關(guān)的內(nèi)皮細胞。例如Corti等[9-10]利用肽庫篩選技術(shù)在體內(nèi)外篩選獲得并證實一系列短肽特異性結(jié)合腫瘤血管，RGD序列可與整合素特異性結(jié)合，并且可對多種腫瘤具有特異的靶向效應。一些小分子多肽除了可以結(jié)合特定的受體，增強細胞穿透性，還可以通過與脂質(zhì)體、微膠粒、樹枝狀大分子共軛將藥物靶向癌細胞[11-12]，提高藥物療效[13-14]。

圖3 TMTP1-DDK和TMTP1-VK對SiHa體外侵襲能力的影響

體內(nèi)外實驗證實，TMTP1不能結(jié)合低轉(zhuǎn)移潛能或不轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，可結(jié)合高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細胞,甚至能識別并結(jié)合只有少數(shù)細胞組成的不典型的肝臟微轉(zhuǎn)移灶，因此,TMTP1是構(gòu)建重組融合毒素的理想靶向分子,這種融合毒素理論上能選擇性殺傷高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞,而對正常組織細胞沒有毒性。動物試驗表明，TMTP1和抗菌肽偶聯(lián)能有效地抑制胃癌的進展和轉(zhuǎn)移[4]。錢敏等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TMTP1-TAT-NBD通過抑制NF-κB基因的激活，進而抑制細胞的增殖和克隆形成，促進卵巢癌細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，抗微生物多肽D(KLAKLAK)2與靶向線粒體啟動凋亡的多肽CNGRC相偶聯(lián)后，可增強抗腫瘤的效應。該多肽D(KLAKLAK)2與促凋亡的抗微生物肽結(jié)構(gòu)相似,并且在真核細胞外保持相對的無毒性,與其他的靶向肽相偶聯(lián)后，可誘導線粒體腫脹，促進細胞的凋亡。前期實驗表明TMTP1-GG-D(KLAKLAK)能特異性地促進高轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞系PC-3M-1E8和胃癌細胞系MKN-45sci的凋亡，但是對低轉(zhuǎn)移的前列腺癌細胞PC-3M-2B4和正常乳腺上皮細胞MCF-10A以及正常肝細胞LO2無作用[16]。本實驗結(jié)果顯示TMTP1-DDK對高轉(zhuǎn)移能力的宮頸癌細胞有特異性的靶向殺傷效應，而對低轉(zhuǎn)移細胞基本沒有作用。該多肽通過靶向殺傷高轉(zhuǎn)移能力細胞是否存在復雜機制及通路？是否在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程中起到相關(guān)的靶向遏制效應？仍有待進一步的深入研究證實。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移分子機制是一系列復雜而多步驟的病理過程。最近藥物發(fā)現(xiàn)，側(cè)重針對分子的靶向治療的推理性藥物設計，這些藥物針對的是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程[17]。本實驗結(jié)果表明,TMTP1-DDK針對宮頸癌高轉(zhuǎn)移能力的細胞有特異的殺傷效應，對低轉(zhuǎn)移和正常細胞基本沒有作用，減輕了對化療機體的毒副作用，在臨床應用上可以聯(lián)合化療藥物，增強靶向殺傷腫瘤轉(zhuǎn)移灶。

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Anti-tumor effects of the peptide TMTP1-DKK on different cervical cancers

WEI Rui，LI Fei，ZHANG Zhen-zhong，CHENG Teng，XI Ling*

(Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To investigate the remarkable specificity and anti-tumor ability of peptide TMTP1-DKK on highly metastatic cervical tumorsinvitro.Methods Cervical cancer cells SiHa and C-33A that had different metastatic capacities were used.The cell invasion was investigated using the Transwell system.Rhodamine was coupled to the peptides TMTP1.Immunofluorescence assay was carried out to determine the specific binding capacities of the TMTP1,SiHa and C-33A.The inhibition rates of cells growth was measured by CKK-8 assay.The SiHa and C-33A cells were treated with different concentrations of TMTP1-DKK and TMTP1-VKinvitro,and the biological behavior changes of cells were assessed by migration and invasion through Transwell assay.Results Cervical cancer cell SiHa had higher metastatic ability than C-33A.Rhodamine-TMTP1 bound specifically to highly metastatic tumor cell line,SiHa,however,Rhodamine-TMTP1 did not bind to thenometastatic cervical cancer cell C-33A.TMTP1-DKK showed higher anti-tumor effects on highly metastatic SiHa compared to C33A,and the difference was significant(P<0.05).Conclusion TMTP1-DKK can inhibit the proliferation of highly metastatic cervical cancer cell SiHa,but it has little effect onnometastatic cervical cancer cell C-33A.These results suggest TMTP1-DKK may be a powerful candidate therapeutic agent for metastatic tumors.

TMTP1;Cervical cancer;Metastatic tumors;Targeted therapy

2014-09-15

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腫瘤生物醫(yī)學中心，武漢430030

國家自然科學基金面上項目(81172468)；華中科技大學研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(01-09-070115)

10.14053/j.cnki.ppcr.201501001

*通信作者