去甲斑蝥素對(duì)非小細(xì)胞肺癌模型小鼠免疫功能的影響

付盈盈，李 林，章 激，張文靜，司應(yīng)明*

去甲斑蝥素對(duì)非小細(xì)胞肺癌模型小鼠免疫功能的影響

付盈盈1，李 林1，章 激2，張文靜2，司應(yīng)明1*

目的 研究去甲斑蝥素體內(nèi)對(duì)非小細(xì)胞肺癌3LL模型小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法 常規(guī)培養(yǎng)3LL細(xì)胞，接種于ICR小鼠，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，陰性對(duì)照組，5-fu陽性對(duì)照組以及NCTD 3個(gè)劑量組，另設(shè)空白對(duì)照組。腹腔注射給藥2周后，取血檢測(cè)血常規(guī)以及血清TNF-α和IFN-γ含量；處死小鼠，分別剝?nèi)×鰤K、脾臟和胸腺，稱重并計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)；取脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞并測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 NCTD體內(nèi)可抑制3LL模型小鼠腫瘤的生長；增加荷瘤小鼠白細(xì)胞總數(shù)；上調(diào)TNF-α和IFN-γ水平；降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)論 NCTD體內(nèi)可調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌3LL模型小鼠的免疫功能。

去甲斑蝥素；3LL；小鼠；TNF-α；IFN-γ

0 引言

肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮，屬于全球范圍內(nèi)的高發(fā)性疾病，其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中已占據(jù)首位[1]，女性的發(fā)病率也逐漸增高。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療腫瘤疾病的技術(shù)已突飛猛進(jìn)，但是即使使用先進(jìn)的分子靶向治療，非小細(xì)胞肺癌患者的生存期也僅有所延長，而生活質(zhì)量依然沒有得到明顯的改善[2]。中藥治療惡性腫瘤，通過扶正除邪，增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的免疫功能，除了抑制腫瘤生長外，還能減輕放療、化療引起的胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，減輕患者痛苦，提高生活質(zhì)量，抗腫瘤效果較好[3]。斑蝥素是從動(dòng)物中提取的抗腫瘤中藥，廣泛應(yīng)用于臨床，但因其有泌尿系不良反應(yīng)和胃腸道反應(yīng)而使其使用受到限制。為此我國又研制合成了斑蝥素衍生物，即去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)，將原分子上1、2位的2個(gè)甲基去除得到，其抗腫瘤作用沒有改變，但不良反應(yīng)明顯降低[4]。去甲斑蝥素在選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時(shí)，可以保護(hù)正常細(xì)胞，已有研究證明，其對(duì)白細(xì)胞總數(shù)具有明顯的上調(diào)作用，還可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能等[5]，與放療、化療聯(lián)合使用，在輔助抗腫瘤的同時(shí)，還減輕了放、化療引起的骨髓抑制等不良反應(yīng)，在腫瘤治療中有著很好的應(yīng)用前景。本研究觀察NCTD體內(nèi)對(duì)非小細(xì)胞肺癌3LL模型小鼠腫瘤的抑制作用，探討其對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，考察其抗肺癌的作用機(jī)制，為NCTD治療非小細(xì)胞肺癌的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 瘤株與動(dòng)物 非小細(xì)胞肺癌系腫瘤3LL細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)藥學(xué)院饋贈(zèng)。ICR小鼠，SPF級(jí)，體重18～20 g，雌雄兼用，購于襄陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：襄醫(yī)動(dòng)字第2001001號(hào)。

1.2 試劑與儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基(Gbico公司)；刀豆蛋白A和MTT(Sigma公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：1121030)；定量檢測(cè)TNF-α和IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；雅培血細(xì)胞分析儀(美國雅培-1700)；電子天平AY-120(日本島津)；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；分析天平(江蘇翔宇電子有限公司)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按常規(guī)將非小細(xì)胞肺癌系腫瘤3LL細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，收集腫瘤細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×107/mL的單細(xì)胞懸液用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 制造模型，分組及給藥 取ICR小鼠，將每只小鼠右前腋皮下注射“2.1”項(xiàng)中配好的3LL細(xì)胞懸液0.2 mL，待至瘤后隨機(jī)分為5組：荷瘤對(duì)照組、陽性對(duì)照組及NCTD高、中、低三個(gè)劑量組，每組10只，另設(shè)正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和荷瘤對(duì)照組灌胃生理鹽水；陽性對(duì)照組以30 mg/kg劑量腹腔注射5-Fu；NCTD三個(gè)濃度組分別按15、30、60 mg/kg劑量腹腔注射給藥，每周給藥4次，連續(xù)用藥2周，用藥期間觀察小鼠的活動(dòng)量和一般狀況。

2.3 檢測(cè)小鼠血常規(guī) 停藥后次日，將各組小鼠摘眼球取血，EDTA抗凝，應(yīng)用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)中白細(xì)胞(WBC)總數(shù)，以及淋巴細(xì)胞(LY)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、單核細(xì)胞(MONO)、嗜酸性粒細(xì)胞(EO)和嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)百分比。

2.4 小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量測(cè)定 將“2.3”項(xiàng)所取的血液靜置后離心(3 000 r/min，10 min)，取血漿，用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中TNF-α、IFN-γ的含量，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。在酶標(biāo)測(cè)試儀上測(cè)定各樣本492 nm處吸光度值。分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清中各細(xì)胞因子的含量。

2.5 檢測(cè)抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù) 取血后頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下將瘤組織、脾臟和胸腺分別剝離出，分析天平稱重。比較各給藥組與對(duì)照組瘤重、脾臟質(zhì)量和胸腺質(zhì)量的差異，并按照公式：抑瘤率(%)=[1-(給藥組平均瘤重/荷瘤對(duì)照組平均瘤重)]×100%；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)，分別計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

2.6 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將“2.3”項(xiàng)中無菌條件下分離出的小鼠脾臟，按常規(guī)方法制成脾淋巴細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/mL。并分別向脾細(xì)胞中加入ConA或LPS，接種于96孔培養(yǎng)板各孔中，另分別設(shè)只含有ConA或LPS的對(duì)照孔。將培養(yǎng)板置于5% CO2、37 ℃飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)48 h，采用MTT法檢測(cè)各孔活細(xì)胞總數(shù)的情況，酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔的OD值。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)荷瘤小鼠血常規(guī)的影響 結(jié)果顯示，模型組小鼠WBC總數(shù)明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各細(xì)胞百分比例失調(diào)。與模型組相比，NCTD三個(gè)劑量組WBC總數(shù)均明顯增多(P<0.05)，具有劑量依賴性，但仍少于正常對(duì)照組；NCTD各組NEUT、LY、MONO、EO和BASO絕對(duì)數(shù)(總數(shù)×比例)逐漸接近正常對(duì)照組。結(jié)果見表1。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.2 對(duì)荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的TNF-α和IFN-γ含量與對(duì)照組相比均明顯降低(P<0.01)；30 mg/kg的5-Fu腹腔注射給藥后顯著提高荷瘤小鼠TNF-α含量，降低IFN-γ含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NCTD三個(gè)劑量均能提高荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 NCTD對(duì)荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量的影響(n=10)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 對(duì)荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥2周后，30 mg/kg劑量的5-Fu腹腔注射給藥可明顯抑制荷瘤小鼠的腫瘤的生長，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；NCTD三個(gè)劑量組(15、30、60 mg/kg)腹腔注射給藥對(duì)荷瘤小鼠瘤塊的生長皆有一定的抑制作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且具有劑量依賴性。見表3。

表3 NCTD對(duì)荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響(n=10)

注：與模型組比較，##P<0.01

3.4 對(duì)荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)皆增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，5-Fu對(duì)脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)影響均較小(P>0.05)，而NCTD三個(gè)劑量均能降低荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，但僅有高劑量NCTD組的脾臟指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 NCTD對(duì)荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(n=10)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.5 對(duì)荷瘤小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 本實(shí)驗(yàn)OD值的大小可以反映小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤小鼠T、B淋巴細(xì)胞的OD值明顯減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；5-Fu(30 mg/kg)腹腔注射給藥使T、B淋巴細(xì)胞的OD值更低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NCTD體內(nèi)給藥皆可顯著增加荷瘤小鼠的T、B淋巴細(xì)胞的OD值，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 NCTD對(duì)荷瘤小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程是多種因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，機(jī)體的免疫功能是其中的一個(gè)因素。當(dāng)機(jī)體免疫功能受到損害時(shí)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因素以及免疫逃逸等作用均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；而當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤以后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)又可通過多種方式和多種細(xì)胞因子作用于腫瘤細(xì)胞，并將其清除，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用[6-7]。因此，通過提高機(jī)體的免疫功能可能達(dá)到抗腫瘤的效果，而機(jī)體的免疫功能又與多種機(jī)制有關(guān)。

外周白細(xì)胞為血液中重要的免疫細(xì)胞，可以幫助身體抵抗疾病以及外來物，在機(jī)體發(fā)生炎癥或其他疾病時(shí)，血液內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)或細(xì)胞分類百分比會(huì)產(chǎn)生變化[8]。脾臟和胸腺都是機(jī)體重要的免疫器官，由脾臟產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分別介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫在機(jī)體抗腫瘤防御中共同發(fā)揮重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示，以15、30、60 mg/kg的劑量分別給小鼠腹腔注射NCTD，在抑制肺癌模型小鼠腫瘤生長的同時(shí)，可顯著升高該小鼠的白細(xì)胞總數(shù)；同時(shí)調(diào)節(jié)荷瘤機(jī)體免疫器官的生長；還明顯促進(jìn)由ConA和LPS分別誘導(dǎo)的肺癌模型小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖，從而證明NCTD對(duì)小鼠的免疫功能具有明顯的促進(jìn)作用。

TNF-α是由免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤退行性變化。除了單核-巨噬細(xì)胞以外，其他如淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等也可以分泌TNF-α[10]。TNF-α能殺傷和消滅腫瘤細(xì)胞，限制腫瘤生長，最終導(dǎo)致腫瘤縮小、壞死而消失，對(duì)正常的機(jī)體和組織無毒性[11]，同時(shí)還能誘導(dǎo)和激活T、B淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞促進(jìn)吞噬功能等作用，因此，TNF-α的含量可直接反映機(jī)體的免疫功能。IFN-γ是活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有多種潛能，在機(jī)體腫瘤發(fā)生、發(fā)展、移植排斥和腫瘤免疫逃逸中均有著重要作用[12-13]。IFN-γ對(duì)癌基因的表達(dá)具有抑制作用，能阻止或減慢腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程；還可激活各種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，發(fā)揮直接殺傷癌細(xì)胞或間接抑制癌基因的作用；誘導(dǎo)腫瘤壞死因子，促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)TNF受體、MHC I1類抗原的表達(dá)，故IFN-γ在臨床上用于抗腫瘤治療已非常廣泛[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠患上腫瘤后TNF-α和IFN-γ含量明顯下降，而經(jīng)NCTD處理后，荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量明顯提高，提示其可提高機(jī)體的免疫功能。

綜上所述，去甲斑蝥素小鼠體內(nèi)能抑制非小細(xì)胞肺癌的生長，其抗腫瘤作用與提高機(jī)體的免疫功能有關(guān)[15]，包括增加白細(xì)胞總數(shù)，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖、上調(diào)TNF-α和IFN-γ水平以及調(diào)節(jié)免疫器官的生長，該效應(yīng)在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著給藥劑量的增加而增強(qiáng)，其產(chǎn)生的抗腫瘤作用可能還有其他作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of NCTD on immune function of mice with non-small cell lung cancer

FU Ying-ying1,LI Lin1,ZHANG Ji2,ZHANG Wen-jing2,SI Ying-ming1*

(1.Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangyang 441000,China;2.Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the immunomodulatory effect of NCTD on mice with 3LL.Methods Cells were cultivatedinvitro,ICR mice were inoculated the cells,then divided into 5 groups:negative control group,positive control group,NCTD three doses of groups,and control group was set in addition.After 2-weeks treatment,venous blood of all mice were collected for immune cell level detection,and the tumors,spleen,as well as thymus were dissected to weight viscera index,and lymphocyte proliferation was tested.Results NCTD inhibited cell growthinvivo,increased WBC in tumor-bearing mice and increased TNF-α and IFN-γ levels.It reduced spleen index and thymus index,promoted T/B lymphocyte proliferation.Conclusion NCTD can regulate immune function in mice with non-small cell lung carcinoma 3LL.

NCTD;3LL;Mice;TNF-α;IFN-γ

2014-09-23

1.襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，襄陽 441000；2.襄陽市中心醫(yī)院，襄陽 441021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201506009