維生素D在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎中的作用研究

趙 晴,婁 巖,孫 燦,付 瑜,車千紅,孔 娟*

·論著·

維生素D在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎中的作用研究

趙 晴1,婁 巖2,孫 燦1,付 瑜1,車千紅1,孔 娟1*

目的 探討維生素D在2.5% 硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎中的作用。方法 隨機(jī)抽取C57BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，將DSS加入飲用水中配成2.5%DSS溶液分別喂食，評(píng)估兩組癥狀評(píng)分及生存時(shí)間。另行體外實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用5%的DSS溶液刺激Caco-2細(xì)胞單層，實(shí)驗(yàn)組加入1,25(OH)2D3，對(duì)照組不予額外處理，測(cè)量?jī)山M細(xì)胞跨膜電阻。結(jié)果 正常野生鼠對(duì)2.5% DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎可耐受，VDR敲除鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，直腸出血，體重顯著降低等，相對(duì)于對(duì)照組癥狀評(píng)分增高，生存時(shí)間縮短。對(duì)照組的細(xì)胞跨膜電阻在4 h內(nèi)逐漸下降，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的跨膜電位在初始階段有所下降，4 h后恢復(fù)正常。結(jié)論 維生素D在2.5% DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎中能夠起到保護(hù)作用。在體外試驗(yàn)中,1,25(OH)2D3能夠抵御DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎,為進(jìn)一步研究維生素D及其信號(hào)系統(tǒng)的功能提供了理論依據(jù)。

維生素D;硫酸葡聚糖鈉;實(shí)驗(yàn)性腸炎；Caco-2細(xì)胞

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，近年來(lái)的研究顯示，其能作為激素參與調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生理功能[1]。維生素D是核受體家族的一員，通過(guò)與維生素D受體(VDR)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)下位基因的作用。維生素D受體(VDR)廣泛存在于各種組織和器官中，與活化的1，25(OH)維生素D結(jié)合，調(diào)節(jié)下游信號(hào)系統(tǒng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D具有極其重要的生理功能，除調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷平衡外[3]，還影響免疫、神經(jīng)、生殖、內(nèi)分泌、上皮及毛發(fā)生長(zhǎng)等[4-5]。故有學(xué)者認(rèn)為，維生素D是一種激素而不只是單純的維生素[6]，稱之為維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)[7]。

炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，一般認(rèn)為IBD是由遺傳、環(huán)境、微生物、免疫因子等因素的復(fù)雜的相互作用所致[8]。以往研究應(yīng)用硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠腸炎模型，可見(jiàn)小鼠呈現(xiàn)不同程度的急性腸炎表現(xiàn)，包括體重增長(zhǎng)緩慢、便血、腹瀉等，病理顯示小鼠結(jié)腸有不同程度的結(jié)腸粘膜腺體結(jié)構(gòu)紊亂，單核細(xì)胞和多核細(xì)胞浸潤(rùn)[9-10]即DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎。

既往的研究表明，維生素D缺乏會(huì)增加患炎癥性腸病的風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。也曾有臨床病例分析提示,潰瘍性結(jié)腸炎患者機(jī)體內(nèi)維生素D儲(chǔ)備降低，維生素D缺乏與疾病活動(dòng)性相關(guān)[13]?？傊?，越來(lái)越多的證據(jù)支持維生素D缺乏與炎癥性腸病之間存在病理性聯(lián)系。為了探索相關(guān)機(jī)制，本研究應(yīng)用DSS誘導(dǎo)的急性實(shí)驗(yàn)性腸炎模型來(lái)觀察維生素D對(duì)腸道損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)抽取C57BL/6源性的野生小鼠10只和VDR敲除小鼠10只，分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，2月齡，體重20～25 g，性別不限，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動(dòng)物飼料。

1.2 試劑與材料 DSS(Wako Pure Chemical Industries Ltd.,日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)，Caco-2細(xì)胞株(American Type Culture Collection,Rochville,MD,美國(guó))，胎牛血清(Hyclone，美國(guó));DMEM 高糖培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó));Millicell 小室(Millipore，美國(guó));Transwell 24 孔培養(yǎng)板(Corning，美國(guó));Millicell ERS 電子伏特計(jì)(美國(guó)Millicell 公司);超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)性腸炎模型的建立 將DSS加入蒸餾水中配成2.5%DSS 溶液，分別給兩組小鼠喂食6 d，自第7天起喂食正常蒸餾水，自然死亡或至12 d后統(tǒng)一處死。

1.4 腸炎的評(píng)估 密切監(jiān)測(cè)小鼠的體重及癥狀，包括腹瀉程度、直腸出血等。癥狀評(píng)分總分為6分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①大便次數(shù)。0分：1～2次/d；1分：3～5次/d；2分：>5次/d。②肉眼血便。0分：無(wú)；1分：有。③直腸脫垂。0分：無(wú)；1分：有。

1.5 Caco-2單層細(xì)胞模型的建立 將Caco-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含5% CO2、相對(duì)濕度90% 的環(huán)境中。將Caco-2 細(xì)胞種植于Transwell 培養(yǎng)板上的Millicell 聚碳酸酯膜小室上(Pore sizes 0.4 μm)，細(xì)胞種植密度為 5.5×105個(gè)/mL。接種后隔日換液，1周后每日換液，培養(yǎng)至21 d，滿足跨膜電阻TEER>200 Ω*cm2。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 將分化良好的Caco-2 細(xì)胞接種于六孔板上培養(yǎng)24 h,接種密度為1 × 107個(gè)/mL。用PBS將分離的細(xì)胞沖洗掉。余下的細(xì)胞單層分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組繼續(xù)置于含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中48 h，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)液中加入1,25(OH)2D3，培養(yǎng)相同時(shí)間。應(yīng)用5%的DSS溶液刺激兩組細(xì)胞單層10 min，用跨膜電阻儀分別于10、20、30、60、90、120、180、240 min測(cè)量?jī)山M細(xì)胞單層跨膜電阻。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠發(fā)生結(jié)腸炎的狀況分析 比較兩組小鼠的結(jié)腸炎臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)VDR敲除鼠進(jìn)展為更為嚴(yán)重的結(jié)腸炎，腹瀉次數(shù)明顯增多，多數(shù)可見(jiàn)肉眼血便，更有甚者發(fā)生了直腸脫垂。依照癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分越高代表結(jié)腸炎臨床癥狀越嚴(yán)重。在給予飲用DSS溶液的第2天和第6天，分別對(duì)兩組小鼠進(jìn)行癥狀評(píng)分。圖1顯示，第2天兩組小鼠的癥狀評(píng)分較初始狀態(tài)升高，證明實(shí)驗(yàn)性腸炎模型建立成功，而VDR敲除鼠的癥狀評(píng)分較正常野生對(duì)照組明顯升高。在第6天，對(duì)照組評(píng)分逐漸下降，而實(shí)驗(yàn)組仍有上升。說(shuō)明正常野生鼠對(duì)2.5% DSS溶液基本耐受，其腸道黏膜可在一定范圍內(nèi)自行修復(fù)，腸道功能也可逐漸恢復(fù)，而VDR敲除鼠喪失了腸道修復(fù)的能力，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其結(jié)腸炎臨床癥狀反而加重。

圖1 兩組小鼠癥狀評(píng)分比較

2.2 兩組小鼠的體重變化比較 如圖2所示，0 d為兩組小鼠的初始體重。在給予DSS溶液的第1天，兩組小鼠體重未見(jiàn)明顯改變，第2天～第6天，兩組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的結(jié)腸炎癥狀，導(dǎo)致體重均有所下降，其中VDR敲除鼠體重下降更為明顯。第6天起，正常野生鼠的體重開(kāi)始回升，結(jié)合圖1的癥狀評(píng)分，與該組小鼠已從實(shí)驗(yàn)性腸炎中逐漸恢復(fù)有關(guān)。而后將DSS溶液更換為正常蒸餾水，對(duì)照組小鼠體重上升更為明顯，至第8天，正常野生鼠的體重已增長(zhǎng)至初始體重的105%。實(shí)驗(yàn)組盡管DSS溶液已撤除，更換為正常蒸餾水，仍未能阻止VDR敲除鼠體重持續(xù)下降的趨勢(shì)。

圖2 兩組小鼠體重比較

2.3 兩組小鼠的存活率比較 如圖3所示。在給予DSS溶液后的6 d內(nèi)，對(duì)照組小鼠全部存活，而VDR敲除鼠隨著腸炎癥狀加重存活率逐漸下降，相應(yīng)的死亡率上升。第7天起，更換DSS溶液為正常蒸餾水至第12 天，VDR敲除鼠并未因此恢復(fù)，呈現(xiàn)出更低的存活率，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束共12 d，80%的VDR敲除鼠死亡。對(duì)照組無(wú)一例死亡。

圖3 兩組小鼠存活率比較

2.4 兩組跨膜電阻比較 Caco-2細(xì)胞單層體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，以1,25(OH)2D3加入培養(yǎng)液中的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，分別測(cè)量?jī)山M細(xì)胞經(jīng)5%DSS溶液浸潤(rùn)后的跨膜電阻，結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)照組的細(xì)胞跨膜電阻在4 h內(nèi)逐漸下降，證明DSS溶液對(duì)Caco-2細(xì)胞單層造成了損害。而實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞跨膜電阻初始階段有所下降，4 h后恢復(fù)正常。提示1,25(OH)2D3能夠抵御DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎，在一定程度上起到保護(hù)和修復(fù)腸道粘膜屏障的作用。

3 討論

流行病學(xué)證據(jù)表明，維生素D缺乏與IBD風(fēng)險(xiǎn)增加之間存在相關(guān)性[11],DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎模型具有人類潰瘍性結(jié)腸炎潰瘍和腸道屏障功能喪失的臨床和病理特點(diǎn)。盡管DSS產(chǎn)生的確切作用尚不清楚，但DSS能夠引起腸道粘膜損傷，最終導(dǎo)致炎癥。為了制造維生素D缺乏的模型，本研究采用VDR敲除鼠。正常條件下VDR敲除鼠除了會(huì)出現(xiàn)一定程度的結(jié)腸粘膜細(xì)胞增生外[14]，并不會(huì)出現(xiàn)腸道功能異常。而在DSS誘導(dǎo)下，VDR敲除鼠腸道粘膜會(huì)出現(xiàn)大量潰瘍。既往有研究報(bào)道了VDR敲除鼠經(jīng)DSS處理后結(jié)腸的初始免疫應(yīng)答[15]，維生素D在抗感染的同時(shí)，調(diào)控抑菌肽的表達(dá)，既能維持腸道黏膜表層屏障的完整，又可修復(fù)腸黏膜通透性。近年來(lái)有關(guān)維生素D在免疫系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用是研究熱點(diǎn)，維生素D可通過(guò)抑制細(xì)胞免疫及自身細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活，來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。因此，維生素D缺乏可危害黏膜屏障，導(dǎo)致黏膜損傷及產(chǎn)生IBD的風(fēng)險(xiǎn)加大[16]。維生素D在調(diào)節(jié)黏膜表面菌群、抑制腸腔細(xì)菌黏附、調(diào)整緊密連接蛋白、維持黏膜屏障完整性、抑制致病菌入侵及移位、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等IBD發(fā)病的環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要作用[17]。本研究顯示，野生鼠大部分對(duì)2.5% DSS耐受，癥狀評(píng)分較低，并隨著用正常蒸餾水代替DSS溶液，野生鼠逐漸恢復(fù)，癥狀評(píng)分進(jìn)一步降低，體重從初期略有下降直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束后反而有所上升，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存活率100%。VDR敲除鼠發(fā)生嚴(yán)重腹瀉、直腸出血、脫水、明顯體重降低，癥狀評(píng)分顯著增高，以至于12 d內(nèi)大量死亡。結(jié)果表明，對(duì)于DSS誘導(dǎo)的粘膜損傷，VDR敲除鼠比正常鼠易感得多。

圖4 兩組跨膜電位比較

Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞，是目前藥物吸收的主要研究方法之一。Caco-2細(xì)胞單層模型是目前公認(rèn)的理想的體外模型，Caco-2 細(xì)胞可在培養(yǎng)條件下，在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上生長(zhǎng)、融合，并自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化和形成緊密聯(lián)結(jié)，分化出絨毛面(腸腔側(cè))和基底面(腸壁側(cè))，其形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)與小腸上皮細(xì)胞相似，因此該細(xì)胞模型成為預(yù)測(cè)藥物在人體小腸吸收以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究的標(biāo)準(zhǔn)篩選工具，是體外考察藥物吸收、代謝等的一個(gè)經(jīng)典模型[18-19]。細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上極為相似，具有相同的細(xì)胞極性和緊密連接[20]，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系。胞飲功能的檢測(cè)也表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞類似，其結(jié)構(gòu)和生化功能均接近于人體小腸上皮細(xì)胞屏障[21]。以上的特性可以恒定維持約20 d。因此可以在這段時(shí)間進(jìn)行藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[22]。

曾有文獻(xiàn)推測(cè)在Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)中，1,25(OH)2D3可通過(guò)增加連接蛋白表達(dá)提高由人腸道上皮細(xì)胞系單層形成的連接緊密性并保留在DSS存在下的緊密連接的結(jié)構(gòu)完整性[8]。本實(shí)驗(yàn)利用相同濃度的DSS溶液在相同條件和時(shí)間刺激Caco-2細(xì)胞單層，加入1,25(OH)2D3實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出細(xì)胞跨膜電阻輕度損傷后迅速恢復(fù)，而未加入1,25(OH)2D3的對(duì)照組表現(xiàn)出細(xì)胞跨膜電阻持續(xù)下降，由此證明兩組細(xì)胞跨膜電阻的差距來(lái)源于是否添加1,25(OH)2D3，推測(cè)1,25(OH)2D3能夠抵御DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎。

綜上所述，本研究表明，當(dāng)維生素D受體缺失時(shí)，小鼠會(huì)出現(xiàn)更加嚴(yán)重的結(jié)腸炎臨床癥狀，表現(xiàn)為體重下降、癥狀評(píng)分升高、死亡率上升；另一方面，添加了活性維生素D的細(xì)胞抵御DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎能力增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，1,25(OH)2D3在腸道損傷的情況下，能夠起到保護(hù)腸道粘膜屏障的作用，為臨床上應(yīng)用1,25(OH)2D3作為炎癥性腸病的一種輔助治療預(yù)防復(fù)發(fā)的有效措施提供了理論依據(jù)[23]。

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Effect of vitamin D on dextran sodium sulfate-induced experimental colitis

ZHAO Qing1,LOU Yan2,SUN Can1,FU Yu1,CHE Qian-hong1,KONG Juan1*

(1.Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2 Computer Department,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To explore the effect of vitamin D on 2.5% DSS-induced experimental colitis.Methods Wild and vitamin D receptor (VDR) knockout C57BL/6 mice were divided into control group (n=10,wild) and experimental group (n=10,VDR knockout).The mice were fed with 2.5% DSS.The symptom score and life time was observed.Invitroexperiments: when Caco-2 monolayers were stimulated with 5% DSS,experimental group was added with 1,25(OH)2D3.The TEER of both groups was determined.Results The mice in control group were mostly resistant to 2.5% DSS-induced experimental colitis.There were a lot of symptoms such as severe diarrhea,rectal bleeding and marked body weight loss in the mice of experimental group.The symptom score of experimental group was higher than that of control group with shorter life time.The TEER gradually decreased within 4 h in control group,in experimental group,the TEER was moderately reduced at the beginning and fully recovered after 4 h.Conclusion Vitamin D can play a protective role on 2.5% DSS-induced experimental colitis,which provides a theoretical evidence for further study of vitamin D and the function of its signal system.

Vitamin D;DSS;Experimental colitis；Caco-2

2015-02-18

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，沈陽(yáng) 110004；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)計(jì)算機(jī)教研室，沈陽(yáng) 110122

國(guó)家自然科學(xué)基金(30971401、81170065)；遼寧省攀登學(xué)者計(jì)劃；遼寧省十百千計(jì)劃

10.14053/j.cnki.ppcr.201506001

*通信作者